Recuperación mejorada de ácidos nucleicos de partículas magnéticas de vidrio.

Un método para separar los ácidos nucleicos a partir de una solución de muestra que contiene ácidos nucleicos,

que comprende

a. poner en contacto la solución de la muestra con una fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos y una mezcla de unión que comprende un compuesto de etileno-amina;

b. incubar la solución de muestra que contiene la fase sólida bajo las condiciones en las que los ácidos nucleicos puede unirse a la fase sólida; y

c. separar la fase sólida de la solución,

en el que dicha fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos comprende partículas que tienen un núcleo magnético y una capa exterior que contiene sílice y dicho compuesto de etileno-amina que tiene una fórmula general NH2-CH2-CH2-(NHCH2-CH2)n-NH2, en el que n es 0 - 10 o más.

Recuperación mejorada de ácidos nucleicos de partículas magnéticas de vidrio CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está relacionada con el campo del aislamiento de ácidos nucleicos y, específicamente, el campo del aislamiento de ácidos nucleicos utilizando soportes sólidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El aislamiento de ácidos nucleicos es un paso importante en el diagnóstico molecular. La calidad y cantidad de los ácidos nucleicos aislados de una muestra afecta en gran medida al éxito de las aplicaciones de diagnóstico. Las aplicaciones clínicas y de campo también exigen que el procedimiento de aislamiento sea rápido y susceptibles de automatización.

Existen muchos procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de diversos organismos y tejidos. Algunos tipos de muestras clínicas y ambientales presentan desafíos especiales para el aislamiento de ácidos nucleicos con éxito. Por ejemplo, ciertos tejidos tales como el hueso contienen gran cantidad de material extracelular que requieren de su eliminación antes de poder acceder a los ácidos nucleicos. Algunos organismos, tales como hongos, plantas y bacterias poseen paredes celulares o membranas externas que requieren de tratamiento químico agresivo. Los reactivos utilizados en los tratamientos agresivos representan un desafío para las aplicaciones posteriores que utilizan los ácidos nucleicos aislados. Por otra parte, la degradación de los ácidos nucleicos diana durante este tratamiento agresivo puede conducir a un resultado falso negativo en la prueba de detección posterior. Sin embargo, para ser clínicamente aceptable, un procedimiento diagnóstico debe tener suficiente sensibilidad, es decir, evitar resultados falsos negativos en las muestras de los pacientes. Por lo tanto en el campo del diagnóstico molecular, hay una necesidad de mejora de los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos con el fin de hacer que los procedimientos de diagnóstico sean sensibles, fiables y fácil de realizar.

Un requisito previo para el éxito de las pruebas de diagnóstico basadas en ácidos nucleicos es el aislamiento de ácidos nucleicos, no degradados y libres de inhibidores. Al mismo tiempo, hay una demanda de procedimientos simples y de fácil automatización de aislamiento de ácido nucleico. Recientemente se ha hecho popular el aislamiento de ácidos nucleicos utilizando soportes sólidos, tales como, por ejemplo, micropartículas esféricas. Especialmente populares son las micropartículas magnéticas que contienen o están recubiertas con una sustancia similar al vidrio, comúnmente conocidas como "partículas de vidrio magnético" o "PVM". Los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos que emplean PVM requieren comparativamente pocos pasos y son fácilmente automatizables. Especialmente populares son las PVM hechas por el método de sol-gel, descritas en la publicación europea EP 1.154.443 o las patentes US 6.255.477 y 6.87.47.

Las descripciones generales y ejemplos específicos de PVM obtenidas mediante el método sol-gel se encuentran fácilmente disponibles en la literatura (véase, por ejemplo la EP 1.154.443). Estas PVM consisten en un núcleo ferromagnético recubierto de material similar al vidrio a base de sílice. El núcleo ferromagnético contiene típicamente óxidos de hierro, por ejemplo, Fe34 o Fe23. El núcleo puede ser un núcleo de hierro simple, o puede estar hecho de un material compuesto. El núcleo también puede consistir en una estructura cristalina, cerámica o similar al vidrio en el que está incrustado óxido de hierro. El revestimiento de vidrio puede constar de material amorfo que contiene óxido de silicio y además puede contener uno o más óxidos metálicos tales como óxido de boro (B23), óxido de aluminio (Al23), óxido de calcio (CaO), óxido de bario (BaO), óxido de potasio (K2), óxido de sodio (Na2), óxido de magnesio (MgO) u óxido de plomo (Pb23). En algunas realizaciones, el vidrio es óxido de silicio y también contiene uno o más compuestos en el siguiente intervalo de concentraciones: B23 (-3%), Al23 (-2%), CaO (- 2%), BaO (-1%), K2 (-2%), Na2 (-2%), MgO (-18%), Pb23 (-15%). El vidrio también puede contener un porcentaje menor (-5%) de un número de otros óxidos tales como Mn23, Ti2, As23, Fe23, CuO y CoO. Las superficies hechas de una composición de vidrio de borosilicato han mostrado ser especialmente eficaces. Los vidrios de borosilicato tienen un contenido de óxido de boro de más del 25%, por ejemplo una composición 7/3 de

s¡o2/ b2o3.

Las partículas magnéticas se modifican en ocasiones con grupos funcionales que facilitan la unión de los ácidos nucleicos. Tales grupos incluyen, sin limitación, oligonucleótidos poli-T, para la captura de ácidos nucleicos que contienen poli-A, estreptavidina, para la captura de ácidos nucleicos marcados con biotina y secuencias sonda específica para la captura de ácidos nucleicos que contienen una secuencia única complementaria a la sonda. Sin embargo, son de utilidad más universal las partículas magnéticas con superficies no modificadas que son capaces de aislar cualquier ácido nucleico presente en la muestra, independientemente de la secuencia.

Un protocolo de aislamiento de ácido nucleico típico usando PVM comienza con la disrupción de las células o tejidos con el fin de liberar los ácidos nucleicos. Los procedimientos de disrupción de los tejidos que se utilizan habitualmente son de naturaleza química, enzimática o física, lo que incluye el ultrasonido, alta presión, fuerzas de cizallamiento, bases fuertes, detergentes o agentes caotrópicos, proteasas o lipasas. Para la lisis química y

enzimática, el reactivo de lisis incluye típicamente un agente tamponante, una sal, una o más de entre sustancias desnaturalizantes y sustancias caotrópicas, una proteasa y opcionalmente, un inhibidor de la nucleasa y un conservante. El reactivo de lisis provoca la digestión de las proteínas, la inhibición de nucleasas, y la solubilización de los lípidos, lipoproteínas y similares. Por ejemplo, el agente tampón puede ser Tris, la sal puede ser una sal de sodio, de potasio, un amonio o una sal de magnesio, tal como un cloruro o un acetato, el detergente puede ser dodecilsulfato de sodio, Triton-X o Tween, el reactivo caotrópico puede ser urea, tio-urea, yoduro de sodio, dodecilsulfato de sodio, perclorato de sodio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio o hidroclorito de guanidinio, el inhibidor de la nucleasa puede ser un quelante tal como EDTA, el conservante puede ser una azida metálica, y la proteasa puede ser proteinasa K. Típicamente, la muestra se incuba con el reactivo de lisis a temperaturas entre 7 y 1°C, por ejemplo, de 9 a 95°C.

Para la mayoría de las muestras, los reactivos y condiciones de lisis descritos anteriormente son suficientes para lograr la lisis de las células y liberar ácidos nucleicos en solución. Por desgracia, para algunos tipos de muestras, la lisis plantea un reto mayor. Algunas células, organismos y tejidos requieren condiciones de lisis agresivas con el fin de romper la pared celular o el tejido y liberar el contenido celular. Por ejemplo, los patógenos Gram-positivos tales como Mycobacterium tuberculosis tienen paredes celulares de peptldogllcano ricas en lípidos. Hay una necesidad mundial de métodos rápidos de detección de M. tuberculosis y otras mlcobacterlas. Sin embargo, el aislamiento de ácidos nucleicos es a menudo un factor limitante para alcanzar los niveles deseables de sensibilidad de los ensayos. Ver Neonakis et al. (28) Molecular diagnostic tools ¡n mlcobacterlology, J. Microbiol. Methods, 75:111. Actualmente la sensibilidad deseada en un ensayo de detección de mlcobacterlas se consigue con un procedimiento de aislamiento de ácido nucleico de múltiples pasos que Incluye pasos repetidos de lavado y centrifugación. Ver Shamputa et al. (24) Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens, APMIS, 122:728. Tal procedimiento, sin embargo, no es automatizable y no es práctico para la mayoría de usuarios.

En un procedimiento típico de aislamiento de ácidos nucleicos usando PVM, después de que los compartimentos celulares en la muestra se han roto para liberar los ácidos nucleicos, la muestra se pone en contacto con las PVM a fin de lograr la unión de los ácidos nucleicos a las PVM. Las PVM se pueden añadir a la muestra antes de la lisis. Por ejemplo, las PVM puede estar presente en el recipiente en el que se añade la muestra inicial. Se ha determinado que la presencia de PVM no afecta a la lisis de la muestra. Alternativamente, la muestra se pueden lisar primero e introducir las PVM sólo después de que se complete la etapa de lisis.

Para lograr la unión a las... [Seguir leyendo]

1. Un método para separar los ácidos nucleicos a partir de una solución de muestra que contiene ácidos nucleicos, que comprende

a. poner en contacto la solución de la muestra con una fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos y una mezcla de unión que comprende un compuesto de etileno-amina;

b. incubar la solución de muestra que contiene la fase sólida bajo las condiciones en las que los ácidos nucleicos puede unirse a la fase sólida; y

c. separar la fase sólida de la solución,

en el que dicha fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos comprende partículas que tienen un núcleo magnético y una capa exterior que contiene sílice y dicho compuesto de etileno-amina que tiene una fórmula general NH2-CH2-CH2-(NHCH2-CH2)n-NH2, en el que n es -1 o más.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además el lavado de los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además la elución de los ácidos nucleicos a partir de la fase sólida.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución de muestra se obtiene mediante la lisis de células.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha solución de muestra se obtiene mediante la lisis de bacterias Gram-positivas seleccionadas de entre un grupo constituido por Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterlum y combinaciones de los mismos.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la mezcla de unión en el paso (a) comprende además iones metálicos.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la mezcla de unión contiene iones magnesio o manganeso.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la mezcla de unión en el paso (a) comprende, además, un hidróxido de un metal alcalino y un detergente.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la mezcla de unión comprende una mezcla de volúmenes iguales de Solución 1 (NaOH 5 mM, Tritón X-1 al 1%, EDTA 1 mM, NaN3 al ,5%, pH 12+) y Solución 2 (etileno-amina 1- 65 mM, Tris 2 mM, MgCI2 5-25 mM, NaN3 al ,5%, pH 7,5)

1. Una mezcla de reacción para la separación de ácidos nucleicos a partir de una muestra que comprende una fase sólida, y que comprende: una fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos, que comprende partículas que tienen un núcleo magnético y una capa externa que contiene sílice, y un compuesto de etileno-amina que tiene una fórmula general NH2-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)n-NH2, en la que n es -1 o más y iones metálicos.

11. La mezcla de reacción de la reivindicación 1, que comprende además un hidróxido de un metal alcalino y un detergente.

12. La mezcla de reacción de la reivindicación 1, que comprende iones magnesio o manganeso.

13. Un equipo para la separación de ácidos nucleicos a partir de una muestra usando una fase sólida, que comprende: una fase sólida capaz de unirse a ácidos nucleicos, que comprende partículas que tienen un núcleo magnético y una capa externa que contiene sílice, un compuesto de etileno-amina que tiene una fórmula general NH2-CH2-CH2-(NH-CH2-CH2)n-NH2, en la que n es -1 o más, y uno o más de entre un reactivo de lisis, un reactivo de neutralización, un reactivo de lavado y un reactivo de elución, en el que el reactivo de lisis contiene un hidróxido de un metal alcalino y un detergente, y el reactivo de neutralización contiene uno de dichos compuestos de etileno- amina, iones magnesio o de manganeso y un tampón.