Ratones ADAM6.

Un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina,

donde la modificación elimina la función endógena de ADAM6, que está asociada a una reducción de la fertilidad en ratones macho, el ratón comprende además secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína ADAM6 de ratón, o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho, y una proteína ADAM6b de ratón, o un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

Ratones ADAM6

Campo de la invención Se describen ratones, células, embriones, y tejidos genéticamente modificados que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un locus de ADAM6 funcional. Las modificaciones incluyen loci de inmunoglobulina humanos y/o humanizados. Se describen ratones que carecen de un gen ADAM6 endógeno funcional pero que comprenden una función de ADAM6, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que codifica una proteína ADAM6. Se describen ratones macho genéticamente modificados que comprenden una modificación de un locus VH de inmunoglobulina endógeno que vuelve a los ratones incapaces de fabricar una proteína ADAM6 funcional y da como resultado una pérdida de fertilidad, y que comprende además la función de ADAM6 en los ratones macho, incluyendo ratones que comprenden una secuencia de ácido nucleico ectópica que restaura la fertilidad en los ratones macho.

Antecedente de la invención Se conocen en la técnica ratones que contienen genes de anticuerpos humanos. Las aplicaciones farmacéuticas para anticuerpos en las dos últimas décadas han impulsado fuertemente la investigación acerca de la preparación de anticuerpos que son adecuados para su uso como agentes terapéuticos humanos. Los primeros agentes terapéuticos basados en anticuerpos, que se basaban en anticuerpos de ratón, no eran ideales como agentes terapéuticos humanos debido a que la administración repetida de anticuerpos de ratón a seres humanos da como resultado una inmunogenicidad puede confundir los regímenes de tratamiento a largo plazo. Se han desarrollado 25 soluciones basadas en anticuerpos de ratón humanizantes que los hacen parecer más humanos y menos similares a los de ratón. Siguieron métodos para expresar secuencias de inmunoglobulina humana para uso en anticuerpos, la mayoría basados en la expresión in vitro de bibliotecas de inmunoglobulina humana en fagos, bacterias, o levaduras. Finalmente, se han hecho intentos de preparar anticuerpos humanos útiles a partir de linfocitos humanos in vitro, en ratones a los que se habían injertado células hematopoyéticas humanas, y en ratones transcromosómicos o transgénicos con loci de inmunoglobulina endógena desactivados. En los ratones transgénicos ha sido necesario desactivar los genes de inmunoglobulina de ratón endógenos para que los transgenes completamente humanos integrados aleatoriamente funcionen como el origen de las secuencias de inmunoglobulina expresadas en el ratón. Dichos ratones pueden fabricar anticuerpos humanos adecuados para el uso como agentes terapéuticos humanos, pero estos ratones presentan problemas sustanciales en sus sistemas inmunes. Estos problemas (1) hacen que los ratones sean poco prácticos para generar un repertorio de anticuerpos suficientemente diverso, (2) requieren el uso de extensas fijaciones de rediseño genético, (3) proporcionan un proceso de selección clonal subóptimo debido probablemente a la incompatibilidad entre elementos humanos y de ratón, y (4) convierten a estos ratones en una fuente no fiable de poblaciones grandes y diversas de secuencias variables humanas necesarias para ser verdaderamente útiles para preparar agentes terapéuticos humanos.

Sigue existiendo una necesidad en la técnica para crear ratones genéticamente modificados que sean útiles en la generación de secuencias de inmunoglobulina, incluyendo secuencias de anticuerpos humanos. Sigue existiendo también una necesidad de ratones que puedan reordenar segmentos génicos de la inmunoglobulina para formar genes de la inmunoglobulina reordenados útiles, o que puedan fabricar proteínas a partir de loci de inmunoglobulina 45 alterados, reduciendo o eliminando al mismo tiempo cambios perjudiciales que puedan ser el resultado de las modificaciones genéticas.

Sumario de la invención En un aspecto, se proporcionan construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones, y métodos para crear ratones que comprenden una modificación que da como resultado una proteína ADAM 6 o un gen ADAM 6 de ratón endógeno no funcional (por ejemplo, una inactivación génica o una deleción en un gen ADAM6 endógeno) , en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho.

Se describen construcciones de ácidos nucleicos, células, embriones, ratones, y métodos para crear ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de inmunoglobulina de ratón, en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho. El locus endógeno de la inmunoglobulina de ratón puede ser un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, y la modificación puede reducir o eliminar la actividad de ADAM6 de una célula o tejido de un ratón macho.

En un aspecto, se proporcionan ratones que comprenden una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento funcional de la misma; se proporcionan ratones que 65 comprenden una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una ADAM6 de ratón o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma, y al menos una modificación genética de un locus de la cadena pesada de la

inmunoglobulina.

En un aspecto, se proporcionan métodos para crear ratones que comprenden una modificación de un locus endógeno de inmunoglobulina de ratón, en el que los ratones comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 o un ortólogo u homólogo o fragmento de la misma que sea funcional en un ratón macho. Se pueden obtener ratones de acuerdo con la invención, por ejemplo, mediante los métodos descritos en el presente documento.

En un aspecto, se proporcionan métodos para crear ratones que comprenden una modificación genética de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en el que la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (o una de sus deleciones) , y los ratones macho pueden generar progenie mediante apareamiento. En una realización, los ratones macho pueden producir esperma que puede atravesar un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón.

En un aspecto, se proporcionan métodos para crear ratones que comprenden una modificación genética de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, en el que la aplicación de los métodos da como resultado ratones macho que comprenden un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (o una de sus deleciones) , y los ratones macho presentan una reducción de la fertilidad, y los ratones comprenden una modificación genética que restaura en todo o en parte la reducción de la fertilidad. En varias realizaciones, la reducción de la fertilidad se caracteriza por una incapacidad del esperma de los ratones macho para migrar desde un útero de ratón a través de un oviducto de ratón para fertilizar un óvulo de ratón. En varias realizaciones, la reducción de la fertilidad se caracteriza por un esperma que presenta un defecto de migración in vivo. En varias realizaciones, la modificación genética que restaura en todo o en parte la reducción de la fertilidad es una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen ADAM6 de ratón o el ortólogo u homólogo o fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

En una realización, la modificación genética comprende sustituir los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena por los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina de otras especies (por ejemplo, una especie no humana) . En una realización, la modificación genética comprende la inserción de los loci de la cadena pesada de inmunoglobulina ortóloga en los loci variables de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En una realización específica, la especie es un ser humano. En una realización, la modificación genética comprende la deleción de un locus variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina endógena en todo o en parte, en el que la deleción da como resultado una pérdida de la función endógena de ADAM6. En una realización específica, la pérdida de la función de ADAM6 endógena se asocia con una reducción de la fertilidad en ratones macho.

Se describen ratones que comprenden una modificación que reduce o elimina la expresión de ADAM6 de ratón de un alelo endógeno de ADAM6 de tal manera que un ratón macho que tiene la modificación presenta una fertilidad reducida (por ejemplo, una capacidad muy reducida para generar progenie mediante apareamiento)... [Seguir leyendo]

1. Un ratón que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde la modificación elimina la función endógena de ADAM6, que está asociada a una reducción de la fertilidad en ratones macho, el ratón comprende además secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína ADAM6 de ratón, o un ortólogo o un homólogo o un fragmento funcional del mismo que es funcional en un ratón macho, y una proteína ADAM6b de ratón, o un ortólogo o un homólogo o un fragmento del mismo que es funcional en un ratón macho.

2. El ratón de la reivindicación 1, en el que las secuencias de ácidos nucleicos se encuentran en un locus endógeno de la inmunoglobulina o en el que las secuencias de ácidos nucleicos están integradas en el genoma de ratón en una posición diferente a la de un locus endógeno de la inmunoglobulina.

3. El ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la modificación del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende una inserción de una o más secuencias génicas de la inmunoglobulina humana o en el que la modificación del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende la sustitución de una o más secuencias de un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias génicas de la inmunoglobulina humana, preferentemente en donde la modificación del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende la sustitución de una secuencia génica endógena de la región variable de la cadena pesada con una secuencia génica de la región variable de la cadena pesada humana, y más preferentemente en donde la modificación del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende la sustitución de uno o más segmentos endógenos de genes V (VH) de la cadena pesada con una o más segmentos endógenos de genes V (VH) de la cadena pesada humana.

4. Un método para modificar un locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de un ratón, que comprende:

(a) .preparar una primera modificación del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón que dé como resultado una eliminación de la actividad endógena de ADAM6 de ratón en un ratón macho; y, (b) .preparar una segunda modificación del ratón para añadir secuencias de ácidos nucleicos que confieran una actividad de ADAM6 de ratón que sea funcional en un macho de ratón, preferentemente en donde las secuencias de ácidos nucleicos en la etapa (b) se añaden en una posición ectópica, cuya secuencia de ácido nucleico codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo, o un homólogo o uno de sus fragmentos funcionales, y una proteína ADAM6b de ratón o un ortólogo, un homólogo o uno de sus fragmentos funcionales.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la primera modificación comprende una inserción de una o más secuencias génicas de la inmunoglobulina humana o en el que la primera modificación comprende la sustitución de una o más secuencias en el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón con una o más secuencias génicas de la inmunoglobulina humana, preferentemente en donde la primera modificación comprende la sustitución de una secuencia génica endógena de la región variable de la cadena pesada con una secuencia génica de la región variable de la cadena variable humana, y más preferentemente en donde la primera modificación comprende la sustitución de uno o más segmentos endógenos de genes VH con uno o más segmentos génicos VH humanos.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que la primera y la segunda modificación se realizan simultáneamente.

7. Una célula aislada o un tejido aislado procedentes de un ratón de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

8. Uso de un ratón de acuerdo con la reivindicación 3 para la generación de

(i) un anticuerpo quimérico, anticuerpo quimérico que comprende regiones variables humanas y regiones constantes de ratón,

(ii) un anticuerpo completamente humano,

(iii) un fragmento Fab completamente humano, y/o

(iv) un fragmento F (ab) 2 completamente humano.

9. Un método para generar un anticuerpo quimérico específico frente a un antígeno, que comprende las etapas de:

a) inmunizar un ratón de acuerdo con la reivindicación 3 con el antígeno; b) aislar al menos una célula del ratón que produce un anticuerpo quimérico específico contra el antígeno, anticuerpo quimérico que comprende regiones variables humanas y regiones constantes de ratón; y c) cultivar al menos una célula produciendo el anticuerpo quimérico de la etapa b) y obtener dicho anticuerpo quimérico,

preferentemente en el que el cultivo en la etapa c) se realiza en al menos una célula de hibridoma generada a partir de al menos una célula obtenida en la etapa b) .

10. Un método para generar un anticuerpo completamente humano específico contra un antígeno, que comprende las etapas de:

a) inmunizar un ratón de acuerdo con la reivindicación 3 con el antígeno; b) aislar al menos una célula del ratón produciendo un anticuerpo quimérico específico contra el antígeno, anticuerpo quimérico que comprende regiones variables humanas y regiones constantes de ratón; c) generar al menos una célula productora de un anticuerpo completamente humano derivado del anticuerpo quimérico de la etapa b) y específico contra el antígeno; y d) cultivar al menos una célula produciendo el anticuerpo completamente humano de la etapa c) y obtener dicho anticuerpo completamente humano.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en el que la al menos una célula obtenida en la etapa b) es un esplenocito o un linfocito B.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la inmunización con el antígeno de la etapa a) se realiza con una proteína, ADN, una combinación de ADN y proteína o células que expresan el antígeno.

14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ADAM6 de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho, y una proteína ADAM6b de ratón o un ortólogo o un homólogo o un fragmento de la misma que es funcional en un ratón macho para el uso en la restauración o en la mejora de la fertilidad de un ratón macho que tiene un genoma que comprende una modificación de un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde la modificación reduce o elimina la función endógena de ADAM6, que se asocia con una reducción de la fertilidad en ratones macho, donde dicha secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma del ratón en un locus endógeno de la inmunoglobulina o en una posición diferente que la de un locus endógeno de la inmunoglobulina.

FIG. 4B

FIG. 6