Proteínas de dominio Kunitz inhibidores de calicreína y ácidos nucleicos que codifican las mismas.

Un polipéptido que inhibe la calicreína que comprende una estructura de dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoácidos:

en donde:

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 pueden estar ausentes;

Xaa10 se selecciona a partir de Asp, Glu, Ala, Gly, Ser, y Thr;

Xaa11 se selecciona a partir de Asp, Gly, Ser, Val, Glu, Leu, Met, Asn ,Ile, Ala y Thr;

Xaa13 se selecciona a partir de Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, 20 Gly, Lys y Gln;

Xaa15 se selecciona a partir de Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln;

Xaa16 se selecciona a partir de Ala, Gly, Ser, Asp, y Asn;

Xaa17 se selecciona a partir de Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr;

Xaa18 se selecciona a partir de His, Leu, Gln, y Ala;

Xaa19 se selecciona a partir de Pro, Gln, Leu, Asn, y Ile;

Xaa20 se selecciona a partir de Arg, Leu, Ala, Ser, Lys, Gln, y Val;

Xaa21 se selecciona a partir de Trp, Phe, Tyr, His y Ile;

Xaa22 se selecciona a partir de Tyr y Phe;

Xaa23 se selecciona a partir de Tyr y Phe;

Xaa31 se selecciona a partir de Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr;

Xaa32 se selecciona a partir de Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val;

Xaa33 se selecciona a partir de Phe y Tyr;

Xaa34 se selecciona a partir de Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu;

Xaa35 se selecciona a partir de Tyr, Trp y Phe;

Xaa36 se selecciona a partir de Gly, Ser y Ala;

Xaa39 se selecciona a partir de Gly, Glu, Ala, Ser y Asp;

Xaa40 se selecciona a partir de Gly y Ala;

Xaa43 se selecciona a partir de Asn y Gly; y

Xaa45 se selecciona a partir de Phe y Tyr;

para su uso en el tratamiento o prevención del edema de la piel, tejido subcutáneo, la laringe, el tracto respiratorio superior o el tracto gastrointestinal en un paciente, en donde dicho edema se asocia con excesiva actividad de calicreína.

Proteínas de dominio Kunitz inhibidores de calicreína y ácidos nucleicos que codifican las mismas 5 Antecedentes de la invención

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con nuevas clases de proteínas y análogos de proteínas que se unen a e inhiben la calicreína 10 plasmática humana.

Descripción de la Técnica Anterior

Las calicreínas son serina proteasas que se encuentran tanto en tejidos como en plasma. La calicreína de plasma está 15 implicada en la coagulación activada por contacto (vía intrínseca), la fibrinolisis, la hipotensión y la inflamación. (Ver BH0092) Estos efectos de la calicreína están mediadas a través de las actividades de tres sustratos fisiológicos distintos: I) Factor XII (coagulación), ¡i) Pro-uroquinasa/plasminógeno (fibrinolisis), y iii) Quininógenos (hipotensión e inflamación).

La escisión de la calicreína a los quininógenos resulta en la producción de cininas, pequeños péptidos bioactivos altamente 20 potentes. Las cininas actúan a través de receptores de la superficie celular presentes en una variedad de tipos de células. Proteínas G heterotriméricas intracelulares enlazan los receptores de cininas a las vías de segundo mensajero, incluyendo óxido nítrico, la adenilato ciclasa, fosfolipasa A2, y fosfolipasa C. Entre las actividades fisiológicas importantes de cininas están: (i) aumento de permeabilidad vascular; (¡i) vasodilatación; (iii) broncoespasmo; y (iv) dolor de inducción. Así, las cininas median el shock vascular que amenaza la vida y el edema asociado con bacteriemia (sepsis) o trauma, el edema y 25 la hiperreactividad de las vías respiratorias del asma, y tanto el dolor inflamatorio como neurogénico asociado con lesión de los tejidos. Las consecuencias de la actividad inadecuada de la calicreína plasmática y la producción clnlna resultante se ¡lustran dramáticamente en pacientes con angioedema hereditario (HA). La HA es debida a una deficiencia genética del inhibidor de C1, el principal inhibidor endógeno de la calicreína plasmática. Los síntomas de la HA Incluyen edema de la piel, tejidos subcutáneos y el tracto gastrointestinal y dolor abdominal y vómitos. Casi un tercio de los pacientes con HA mueren 30 por asfixia debido a edema de la laringe y el tracto respiratorio superior. La calicreína se secreta como un zimógeno (precalicreína) que circula como una molécula inactiva hasta que es activado por un evento proteolítico que libera el +NH3- IVGGTNSS... secuencia de la calicreína (sec. con núm. de ident. 1). La Precalicreína Humana de Plasma se encuentra en Genebank entrada P03952.

La calicreína madura de plasma contiene 619 aminoácidos. La hidrólisis del enlace peptídlco Arg37i-lle372 produce una proteinasa de dos cadenas unidas por un enlace disulfuro. La cadena ligera amlno-termlnal (residuos 248) lleva el sitio catalítico.

El principal Inhibidor de la calicreína plasmática (pKA) in vivo es el Inhibidor de Cl; ver SCHM87, pp.27-28. La Cl es una 40 serplna y forma un complejo esencialmente irreversible con pKA. Aunque el Inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) fue el primer Inhibidor fuerte de pKA con «i = 320 pM (AUER88), BERN93 Indica que su «¡para pKA es 30 nM (por ejemplo, 30,000 pM). El mutante G36S tenía una Ki de más de 500 nM. Así, existe una necesidad de un Inhibidor de la calicreína seguro. Los atributos esenciales de un agente de este tipo son:

451. I. La neutralización de la enzlma(s) calicreína pertinente;

II. Unión de alta afinidad a calicreínas para minimizar la dosis diana;

III. Alta especificidad para la calicreína, para reducir los efectos secundarios; y

IV. Alto grado de similitud con una proteína humana para minimizar la ¡nmunogenlcldad potencial y la toxicidad de órganos/tejidos.

502.

Las calicreínas candldatas diana para ser Inhibidas son serina proteasas homologas a qulmotrlpslna.

Sangrado Excesivo

El sangrado excesivo puede ser resultado a partir de una actividad deficiente de la coagulación, la actividad fibrinolítica elevada, o una combinación de los dos. En la mayoría de las diátesis hay que controlar la actividad de la plasmina. Sin embargo, la calicreína plasmática (pKA) es un activador de plasminógeno y un Inhibidor potente, un Inhibidor selectivo de pKA puede evitar la activación del plasminógeno. El efecto clínico beneficioso de BPTI en la reducción de la pérdida de

sangre se cree que es resultado a partir de su inhibición de la plasmina (Kd ~ 0.3 nM) o de la calicreína plasmática (Kd ~ 100 nM) o ambas enzimas. Se ha encontrado, sin embargo, que BPTI es suficientemente antigénico que segundos usos requieren pruebas de la piel. Además, las dosis de BPTI requeridas para controlar el sangrado son bastante altas y el mecanismo de acción no está claro. Algunos dicen que el BPTI actúa en plasmina, mientras que otros dicen que actúa mediante la inhibición de la calicreína plasmática. FRAE89 reporta que las dosis de aproximadamente 840 mg de BPTI a 80 pacientes de cirugía a corazón abierto reducen la pérdida de sangre casi a la mitad y la cantidad media transfundida se redujo en 74%. Miles Inc. ha introducido recientemente Trasylol en EE.UU. para la reducción de la hemorragia en la cirugía (Véase el folleto del producto Miles de Trasylol, LOHM93 sugiere que los inhibidores de plasmina pueden ser útiles en el control de la hemorragia en la cirugía del ojo. SHER89 reporta que el BPTI puede ser útil para limitar la hemorragia en la cirugía de colon.

Un inhibidor de la calicreína que es mucho más potente que el BPTI y que es casi idéntica a una proteína de dominio humano ofrece un potencial terapéutico similar, permite que la dosis se reduzca, y supone un menor potencial de antigenicidad.

Con las técnicas de ADN recombinante, se puede obtener una nueva proteína mediante la expresión de un gen mutado de una proteína parental. Varias estrategias se conocen para recoger mutaciones para prueba. Una "cirugía de proteína", implica la introducción de una o más mutaciones predeterminadas en el gen de elección. Un único polipéptido de secuencia completamente predeterminada se expresa, y se evalúan sus características de unión.

En el otro extremo está la mutagénesis aleatoria mediante mutágenos relativamente inespecíficos, como la radiación y diversos agentes químicos, ver Lehtovaara, E.P. Appln. 285,123, o por la expresión de ADN altamente degenerados. También es posible seguir una estrategia intermedia en la que algunos residuos se mantienen constantes, otros se mutan al azar, y otros aún se mutan de una manera predeterminada. Esto se denomina "variegación". Ver Ladner, y otros. USP 5,220,409.

DENN94a y DENN94b reportan selecciones de dominios Kunitz basados en APP-I para la unión al complejo del Factor Tisular con el Factor Vil. No usaron LACI-K1 como parental y no usaron pKA como una diana. La mayor afinidad de unión que obtuvieron tenía KD para su diana de aproximadamente 2 nM. Nuestros seleccionados de la primera ronda para la unión a pKA tienen afinidad de aproximadamente 0.3 nM, y nuestros seleccionados de la segunda ronda están cerca de 0.1 nM (= 100 pM) o mejor.

Las proteínas extraídas a partir de una especie en particular se supone que son menos propensas a causar una respuesta inmune cuando se inyectan en los individuos de esa especie. Los anticuerpos murinos son altamente antigénicos en seres humanos. Los anticuerpos "quiméricos" que tienen dominios constantes humanos y dominios variables murinos decididamente son menos antigénicos. Los denominados anticuerpos "humanizados" tienen dominios constantes humanos y dominios variables en las que las CDRs se toman de los anticuerpos murinos, mientras que el marco de los dominios variables son de origen humano. Los anticuerpos "humanizados" son mucho menos antigénicos que los anticuerpos "quiméricos". En un anticuerpo "humanizado", cincuenta a sesenta residuos de la proteína son de origen no humano. Las proteínas de esta invención comprenden, en la mayoría de los casos, sólo aproximadamente sesenta aminoácidos y por lo general hay diez o menos diferencias entre la proteína manipulada y la proteína parental. Aunque los seres humanos desarrollan anticuerpos incluso a proteínas humanas, tales como la insulina humana, tales anticuerpos tienden a unirse débilmente y frecuentemente no impiden que la proteína inyectada muestre su función biológica deseada. El uso de una proteína de la especie a tratar no garantiza que no habrá respuesta inmune. Sin embargo, escogiendo una proteína muy parecida en secuencia a una proteína humana reduce en gran medida el riesgo de una fuerte respuesta inmune en los seres humanos.

Los dominios Kunitz son altamente estables... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que inhibe la calicreína que comprende una estructura de dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoácidos:

Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11 -Gly-Xaa13- Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25- Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Gly-Cys- Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50- Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa57-Xaa58,

en donde:

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 pueden estar ausentes;

Xaa10 se selecciona a partir de Asp, Glu, Ala, Gly, Ser, y Thr;

Xaa11 se selecciona a partir de Asp, Gly, Ser, Val, Glu, Leu, Met, Asn ,lle, Ala y Thr;

Xaa13 se selecciona a partir de Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln;

Xaa15 se selecciona a partir de Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln;

Xaa16 se selecciona a partir de Ala, Gly, Ser, Asp, y Asn;

Xaa17 se selecciona a partir de Ala, Asn, Ser, lie, Gly, Val, Gln y Thr;

Xaa18 se selecciona a partir de His, Leu, Gln, y Ala;

Xaa19 se selecciona a partir de Pro, Gln, Leu, Asn, y lie;

Xaa20 se selecciona a partir de Arg, Leu, Ala, Ser, Lys, Gln, y Val;

Xaa21 se selecciona a partir de Trp, Phe, Tyr, His y lie;

Xaa22 se selecciona a partir de Tyr y Phe;

Xaa23 se selecciona a partir de Tyr y Phe;

Xaa31 se selecciona a partir de Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, lie y Thr;

Xaa32 se selecciona a partir de Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val;

Xaa33 se selecciona a partir de Phe y Tyr;

Xaa34 se selecciona a partir de Thr, lie, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu;

Xaa35 se selecciona a partir de Tyr, Trp y Phe;

Xaa36 se selecciona a partir de Gly, Ser y Ala;

Xaa39 se selecciona a partir de Gly, Glu, Ala, Ser y Asp;

Xaa40 se selecciona a partir de Gly y Ala;

Xaa43 se selecciona a partir de Asn y Gly; y Xaa45 se selecciona a partir de Phe y Tyr;

para su uso en el tratamiento o prevención del edema de la piel, tejido subcutáneo, la laringe, el tracto respiratorio superior o el tracto gastrointestinal en un paciente, en donde dicho edema se asocia con excesiva actividad de calicreína

2. El polipéptido para uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido inhibidor de la calicreína comprende la secuencia de aminoácidos y en donde:

Xaa10 se selecciona a partir de Asp, y Glu;

Xaa11 se selecciona a partir de Asp, Gly, Ser, y Val;

Xaa13 se selecciona a partir de Arg, His, Pro, Asn, y Ser;

Xaa15 se selecciona a partir de Arg, y Lys;

Xaa16 se selecciona a partir de Ala, y Gly;

Xaa17 se selecciona a partir de Ala, Asn, Ser, y lie;

Xaa18 se selecciona a partir de His, Leu, y Gln;

Xaa19 se selecciona a partir de Pro, Gln, y Leu;

Xaa20 es Arg;

Xaa21 se selecciona a partir de Trp, y Phe;

Xaa31 es Glu;

Xaa32 se selecciona a partir de Glu, y Gln;

Xaa33 es Phe;

Xaa34 se selecciona a partir de Thr, lie, y Ser Xaa35 es Tyr;

Xaa36 es Gly; y

Xaa39 se selecciona a partir de Gly, Glu, y Ala.

El polipéptido para uso de la reivindicación 2, en donde el polipéptido inhibidor de la calicreína comprende la secuencia de aminoácidos y en donde:

Xaa10 es Asp;

Xaa11 se selecciona a partir de Asp, y Gly;

Xaa13 se selecciona a partir de Arg, y His;

Xaa15 es Arg;

Xaa16 se selecciona a partir de Ala, y Gly;

Xaa17 se selecciona a partir de Ala, y Asn;

Xaa18 es His; y

Xaa19 se selecciona a partir de Pro, Gln, y Leu

El polipéptido para uso de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibidor de calicreína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en sec. con núm. de ¡dent:5, sec. con núm. de ¡dent:6, sec. con núm. de ident:7, sec. con núm. de ident:8, sec. con núm. de ¡dent:9, sec. con núm. de ident: 10, sec. con núm. de ident: 11, sec. con núm. de ident.:14, sec. con núm. de ident.: 15, sec. con núm. de ident.:16, sec. con núm. de ident.: 17, sec. con núm. de ident.:19, sec. con núm. de ident.:20, sec. con núm. de ident.:21, sec. con núm. de

ident.:22, sec. con núm. de; ident.:23, sec. con núm. de ¡dent.:24, sec. con núm. de ident.:25, sec. con núm. de

ident.:26, sec. con núm. de ident.:27, sec. con núm. de ¡dent.:28, sec. con núm. de ident.:29, sec. con núm. de

ident.:30, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ¡dent.:32, sec. con núm. de ident.:34, sec. con núm. de

ident.:36, sec. con núm. de ident.:38, sec. con núm. de ¡dent.:40 sec. con núm. de ident.:46, sec. con núm. de

ident.:51, sec. con núm. de ¡dent.:54 y sec. con núm. de ¡dent.:55.

Uso de un polipéptido inhibidor de la calicreína que comprende una estructura de dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se define en la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el edema de la piel, tejido subcutáneo, la laringe, el tracto respiratorio superior o el tracto gastrointestinal en un paciente, en donde dicho edema se asocia con actividad excesiva de la calicreína.

El uso de la reivindicación 5, en donde el polipéptido inhibidor de calicreína comprende la secuencia de

aminoácidos y en donde

Xaa10 se selecciona Xaa11 se selecciona Xaa13 se selecciona Xaa15 se selecciona Xaa16 se selecciona Xaa17 se selecciona Xaa18 se selecciona Xaa19 se selecciona Xaa20 es Arg;

Xaa21 se selecciona Xaa31 es Glu;

Xaa32 se selecciona Xaa33 es Phe; Xaa34 se selecciona Xaa35 es Tyr;

Xaa36 es Gly; y Xaa39 se selecciona

a partir de Asp, y Glu; a partir de Asp, Gly, Ser, y Val; a partir de Arg, His, Pro, Asn, y Ser; a partir de Arg, y Lys; a partir de Ala, y Gly; a partir de Ala, Asn, Ser, y lie; a partir de His, Leu, y Gln; a partir de Pro, Gln, y Leu;

a partir de Trp, y Phe;

a partir de Glu, y Gln;

a partir de Thr, lie, y Ser

a partir de Gly, Glu, y Ala.

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el polipéptido inhibidor de la calicreína comprende la secuencia de aminoácidos y en donde

Xaa10 es Asp;

Xaa11 se selecciona a partir de Asp, y Gly;

Xaa13 se selecciona a partir de Arg, y His;

Xaa15 es Arg;

Xaa16 se selecciona a partir de Ala, y Gly;

Xaa17 se selecciona a partir de Ala, y Asn;

Xaa18 es His; y

Xaa19 se selecciona a partir de Pro, Gln, y Leu

8. El uso de la reivindicación 5, en el que el polipéptido inhibidor de la calicreína comprende una secuencia de 15 aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en sec. con núm. de ident.:5, sec. con núm. de ident.:6, sec. con

núm. de ident.:7, sec. con núm. de ident.:8, sec. con núm. de ident.:9, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:11, sec. con núm. de ident.:14, sec. con núm. de ident.:15, sec. con núm. de ident.:16, sec. con núm. de

ident.:17, sec. con núm. de ident.:19, sec. con núm. de ident.:20, sec. con núm. de ident.:21, sec. con núm. de

ident.:22, sec. con núm. de; ident.:23, sec. con núm. de ident.:24, sec. con núm. de ident.:25, sec. con núm. de

ident.:26, sec. con núm. de ident.:27, sec. con núm. de ident.:28, sec. con núm. de ident.:29, sec. con núm. de

ident.:30, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, sec. con núm. de ident.:34, sec. con núm. de

ident.:36, sec. con núm. de ident.:38, sec. con núm. de ident.:40 sec. con núm. de ident.:46, sec. con núm. de

ident.:51, sec. con núm. de ident.:54 y sec. con núm. de ident.:55.