Vectores de presentación eucariotas multicatenarios y usos de los mismos.

Un método para presentar una población heterogénea de polipéptidos multicatenarios biológicamente activos,

comprendiendo cada polipéptido multicatenario dos o más cadenas polipeptídicas, sobre la superficie de células delevadura diploides, que comprende:

proporcionar células de levadura, comprendiendo cada célula de levadura:

(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una cadena de un polipéptidomulticatenario biológicamente activo, estando el polipéptido enlazado a un anclaje de la superficiecelular, y

(ii) uno o más polinucleótidos adicionales que codifican uno o más polipéptidos que comprenden laotra cadena o cadenas del polipéptido multicatenario, estando el uno o más polipéptidos enlazados aun anclaje de la superficie celular, en el que las células de levadura diploides son capaces de expresary segregar las cadenas de los polipéptidos multicatenarios; y

cultivar las células de levadura en condiciones suficientes para permitir la expresión y asociación de lascadenas de los polipéptidos multicatenarios, en el que, para cada célula de levadura, el polipéptidomulticatenario biológicamente activo está unido a la superficie de la célula de levadura mediante el anclaje dela superficie celular, y las cadenas del polipéptido multicatenario se asocian de tal manera que la actividadbiológica del polipéptido multicatenario se muestra en la superficie de la célula de levadura,

en el que las células de levadura diploides cultivadas presentan colectivamente la población heterogénea delos polipéptidos multicatenarios biológicamente activos.

Vectores de presentación eucariotas multicatenarios y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El desarrollo de la tecnología de presentación en fagos, mediante la cual se expresan y anclan polipéptidos o proteínas no nativas (heterólogas) sobre la superficie (“presentación”) de un bacteriófago, es una herramienta potente para la identificación de moléculas que poseen actividades biológicas de interés, por ejemplo ligandos peptídicos que se unen con especificidad y/o afinidad alta a una molécula diana determinada. Es posible clonar en marco bibliotecas de oligonucleótidos sintéticos en la secuencia codificante de genes que codifican una proteína de superficie de fago, por ejemplo el gen III o el gen VIII del fago M13. Estos clones, cuando se expresan, se “presentan” sobre la superficie del fago en forma de una pluralidad, debido a la variación en la secuencia de los oligonucleótidos usados, de proteínas de fusión péptido-cápside. Estas bibliotecas de presentación de péptidos se exploran entonces para determinar la unión a moléculas diana, habitualmente por selección de afinidad o “bioselección” (Ladner, R. et al., 1993; Kay et al, 1996; Hoogenboom, H, et al, 1997) .

La identificación de bibliotecas de presentación de fagos presenta numerosas ventajas con respecto a otros métodos de identificación debido al elevado número de diferentes polipéptidos (típicamente, de más de 1 x 109) que pueden estar contenidos en una única biblioteca de presentación de fagos. Esto permite la identificación de una biblioteca altamente diversa en una sola etapa de identificación. La presentación en fagos de pequeños péptidos o proteínas monocatenarias es ventajosa mientras no se requiera o desee un procesamiento intracelular o una modificación post-traduccional (de lo que no son capaces los fagos o los huéspedes procariotas) . Por ejemplo, la presentación eficaz de un polipéptido heterólogo puede requerir diversas modificaciones post-traduccionales, estructuras intracelulares y una serie de enzimas especializadas y proteínas chaperonas que son necesarias para transportar, glicosilar, adaptar, reunir y anclar adecuadamente el polipéptido de presentación sobre la superficie de la célula hospedadora; sin embargo, ninguno de estos procesos se puede conseguir mediante procesos de bacteriófagos o células procariotas.

Para la presentación de proteínas eucariotas más complejas, por ejemplo polipéptidos multicatenarios que incluyen inmunoglobulinas y fragmentos funcionales de las mismas (por ejemplo, Fab) , o de los dominios extracelulares de moléculas de MHC o moléculas receptoras de células T, es preciso superar problemas adicionales: la expresión coordinada de las cadenas componentes a los niveles de expresión suficientes para producir productos multicatenarios, el transporte y secreción de cada cadena, logrando al mismo tiempo la asociación en un polipéptido multicatenario funcional, y la inmovilización (anclaje) de al menos una cadena del polipéptido multicatenario en la superficie de la célula hospedadora (es decir, para su presentación) , a la vez que se retiene la unión y funcionalidad apropiada fuera de la célula hospedadora del producto polipeptídico multicatenario.

Se han dado a conocer sistemas de presentación que utilizan células eucariotas, tales como levaduras, para expresar y presentar polipéptidos monocatenarios (Boder, E. y Wittrup, K., 1998; Horwitz, A. et al., 1988; Kieke M. et al., 1997; Kieke, M. et al., 1999; documentos WO 94/18330; WO 99/36569) ; sin embargo, existe la necesidad de sistemas eucariotas optimizados para la expresión y presentación funcional de polipéptidos multicatenarios, particularmente inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas. Además, existe en la técnica la necesidad de presentar polipéptidos en un sistema que utilice el poder de la presentación en fagos y las ventajas de procesamiento de las células hospedadoras eucariotas. Por ejemplo, en contraste con las bibliotecas de presentación en fagos, el tamaño práctico máximo, o “diversidad”, de una biblioteca que se puede expresar en y presentar sobre la superficie de una célula hospedadora eucariota es alrededor de 106 a 107.

Estos y otros problemas técnicos han obstaculizado el avance de las herramientas y técnicas biológicas útiles para identificar nuevas moléculas que poseen actividades biológicas interesantes. A causa de estos problemas técnicos, hasta la fecha no se han dado a conocer materiales ni métodos para la construcción satisfactoria de un vector de presentación eucariota multicatenario, de la presentación satisfactoria de un polipéptido multicatenario (tal como un anticuerpo o un fragmento Fab) sobre la superficie de una célula hospedadora eucariota (tal como una levadura) , de la creación de una biblioteca de presentación de polipéptidos multicatenarios en células hospedadoras eucariotas, ni del uso eficaz de estas bibliotecas para detectar y aislar polipéptidos multicatenarios específicos de interés (por ejemplo, sobre la base de especificidad o afinidad de unión por una molécula diana) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Estas y otras deficiencias de la técnica se resuelven mediante vectores de presentación mejorados, células que contienen bibliotecas de presentación, y métodos para el uso de estas bibliotecas y vectores descritos aquí. De forma específica, la presente descripción proporciona un vector de presentación eucariota capaz de presentar un polipéptido multicatenario en la superficie de una célula hospedadora, de manera que la actividad biológica del polipéptido multicatenario se muestra en la superficie de la célula hospedadora. Un vector de este tipo permite la presentación de polipéptidos biológicamente activos más complejos, por ejemplo polipéptidos multicatenarios biológicamente activos, que la que se puede obtener a través de la tecnología de presentación en fagos convencional.

La presente descripción se refiere a la presentación y aislamiento de polipéptidos biológicamente activos. Específicamente, la presente invención se refiere al diseño y uso de nuevos vectores de presentación multicatenarios.

La presente invención describe y hace posible la presentación satisfactoria de un polipéptido multicatenario en la superficie de una célula hospedadora eucariota. Se describen vectores preferidos para expresar las cadenas de un polipéptido multicatenario en una célula hospedadora por separado e independientemente (por ejemplo, bajo elementos distintos de control de vectores y/o en vectores de presentación distintos, formando de este modo un conjunto de vectores correspondiente) . El uso de estos conjuntos de vectores correspondientes proporciona un nivel de flexibilidad y versatilidad en la generación de bibliotecas de presentación, por ejemplo la capacidad para generar y presentar polipéptidos multicatenario combinando y recombinando vectores que expresan una diversidad de las cadenas individuales de un polipéptido multicatenario. Es posible diseñar repertorios completos de nuevas combinaciones de cadenas con el uso de estos conjuntos de vectores.

Adicionalmente, la invención proporciona la capacidad de combinar la tecnología de presentación en fagos (con su facilidad de manipulación y su magnitud de diversidad) con la complejidad y versatilidad potenciales de un vector (o conjunto de vectores) de presentación eucariota multicatenario. Los métodos particulares descritos en este documento permiten a un facultativo transferir eficazmente información sobre secuencias de una biblioteca de péptidos (o miembros seleccionados de la biblioteca) entre sistemas de presentación en fagos y de presentación en eucariotas, lo que se logra a través de la transferencia física de la información de secuencia desde un vector de presentación a otro (usando técnicas de ingeniería genética convencionales) , o a través del uso de un nuevo vector de presentación dual, que se puede utilizar en sistemas tanto de presentación eucariota como de presentación en fagos (que necesariamente implica la expresión procariota) .

La presente descripción se refiere a un vector nuevo, de utilidad en una célula hospedadora eucariota para presentar un polipéptido multicatenario en la superficie de la célula eucariota, de manera que en la superficie de la célula hospedadora se muestra una actividad biológica del polipéptido multicatenario, por ejemplo la actividad de unión de un polipéptido multicatenario. Aunque una realización preferida del vector es la de un único paquete genético replicable, el vector de presentación eucariota multicatenario puede existir como un vector único o como múltiples vectores independientes de un conjunto de... [Seguir leyendo]

1. Un método para presentar una población heterogénea de polipéptidos multicatenarios biológicamente activos, comprendiendo cada polipéptido multicatenario dos o más cadenas polipeptídicas, sobre la superficie de células de levadura diploides, que comprende:

proporcionar células de levadura, comprendiendo cada célula de levadura:

(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una cadena de un polipéptido multicatenario biológicamente activo, estando el polipéptido enlazado a un anclaje de la superficie celular, y

(ii) uno o más polinucleótidos adicionales que codifican uno o más polipéptidos que comprenden la

otra cadena o cadenas del polipéptido multicatenario, estando el uno o más polipéptidos enlazados a un anclaje de la superficie celular, en el que las células de levadura diploides son capaces de expresar y segregar las cadenas de los polipéptidos multicatenarios; y

cultivar las células de levadura en condiciones suficientes para permitir la expresión y asociación de las cadenas de los polipéptidos multicatenarios, en el que, para cada célula de levadura, el polipéptido multicatenario biológicamente activo está unido a la superficie de la célula de levadura mediante el anclaje de la superficie celular, y las cadenas del polipéptido multicatenario se asocian de tal manera que la actividad biológica del polipéptido multicatenario se muestra en la superficie de la célula de levadura,

en el que las células de levadura diploides cultivadas presentan colectivamente la población heterogénea de los polipéptidos multicatenarios biológicamente activos.

2. El método según la reivindicación 1, en el que las células de levadura diploides se preparan mediante las etapas de:

fusionar una primera célula de levadura haploide que comprende un polinucleótido que codifica una cadena del polipéptido multicatenario que está enlazado a un anclaje de la superficie celular con una segunda célula de levadura haploide que comprende uno o más polinucleótidos que codifican una o más de las otras cadenas del polipéptido multicatenario en condiciones suficientes para permitir que las células se fusionen, produciendo de ese modo una célula de levadura diploide, en el que la primera célula de levadura haploide y la segunda célula de levadura haploide son de tipo de apareamiento opuesto, especialmente en el que la primera y segunda células de levadura haploides son células de Saccharomyces cerevisiae.

3. El método según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que cada una de las células de levadura diploides 30 comprende tres polinucleótidos que codifican tres cadenas que forman el polipéptido multicatenario.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la población heterogénea de polipéptidos multicatenarios biológicamente activos comprende cada una al menos un dominio de cadena pesada de una inmunoglobulina y un dominio de cadena ligera de una inmunoglobulina.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la población heterogénea de polipéptidos multicatenarios

biológicamente activos comprende cada una cuatro cadenas, y una de ellas está enlazada a un anclaje de la superficie celular.

6. El método según la reivindicación 2, en el que la primera célula haploide comprende un polinucleótido que codifica un dominio de cadena pesada de una inmunoglobulina, y la segunda célula haploide comprende un polinucleótido que codifica un dominio de cadena ligera de una inmunoglobulina.

7. El método según la reivindicación 4 ó 6, en el que el dominio de cadena pesada incluye un VH y CH1.

8. El método según la reivindicación 4, 6 ó 9, en el que el dominio de cadena ligera incluye un VL y CL.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anclaje de la superficie celular es !aglutinina, a-aglutinina, Aga1p, Aga2p o FLO1.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de levadura son

Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Debar y omyces y Candida, especialmente Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe o Yarrowia lipolytica, en particular Saccharomyces cerevisiae.

11. Un método para detectar un polipéptido multicatenario biológicamente activo que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas a partir de una librería de polipéptidos multicatenarios, que comprende:

proporcionar una librería de células de levadura que presenta una población heterogénea de polipéptidos multicatenarios biológicamente activos sobre la superficie de células de levadura diploides mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores;

aislar células de levadura diploides que presentan la actividad biológica.

12. Un método para detectar y aislar uno o más polipéptidos multicatenarios que presentan una actividad biológica de interés, que comprende:

proporcionar una pluralidad de células de levadura que presentan una población heterogénea de polipéptidos multicatenarios biológicamente activos sobre la superficie de células de levadura diploides mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

poner en contacto las células de levadura con una molécula de interés; y

seleccionar y aislar células que muestran una interacción particular con la molécula de interés, particularmente i) en el que se aísla una célula de levadura que presenta el polipéptido multicatenario que muestra la actividad biológica de interés, y, opcionalmente, se somete a al menos una ronda adicional de selección; o ii) que comprende además identificar la librería usando una identificación de presentación en fagos; o iii) en el que la actividad biológica de interés es una interacción entre el polipéptido multicatenario y otra especie molecular, y comprende una asociación no covalente entre la especie molecular, en particular en el que la interacción es transitoria o es una interacción covalente.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se presentan sobre las superficies de las células de levadura al menos 107 polipéptidos multicatenarios biológicamente activos.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se presentan sobre la superficie de las células de levadura diploides al menos 104 polipéptidos multicatenarios, particularmente al menos 107 polipéptidos multicatenarios, especialmente al menos 108 polipéptidos multicatenarios.