INHIBIDORES DE LA PLASMINA HUMANA DERIVADOS DE DOMINIOS KUNITZ Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS.

Uso de un polipéptido inhibidor de plasmina aislado que comprende una estructura de dominio Kunitz,

que comprende una secuencia de aminoácido que tiene la fórmula

Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Gly-Xaa13-Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa17- Xaa18-Xaa19-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe- Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49- Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa57-Xaa58, en la que

cualquiera de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 puede estar ausente;

Xaa10 se selecciona de Asp y Glu;

Xaa11 se selecciona de Thr, Ala y Ser;

Xaa13 es Pro;

Xaa15 es Arg;

Xaa16 es Ala;

Xaa17 es Arg;

Xaa18 es Phe;

Xaa19 se selecciona de Glu y Asp;

Xaa21 se selecciona de Phe y Trp;

Xaa22 se selecciona de Tyr y Phe;

Xaa23 se selecciona de Tyr y Phe;

Xaa31 se selecciona de Asp y Glu;

Xaa32 se selecciona de Thr, Ala y Glu;

Xaa34 se selecciona de Val, IIe y Thr;

Xaa35 es Tyr;

Xaa36 es Gly;

Xaa39 se selecciona de Glu, Gly y Asp;

Xaa40 se selecciona de Gly y Ala;

Xaa43 se selecciona de Asn y Gly; y

Xaa45 se selecciona de Phe y Tyr,

en la preparación de un medicamento para tratar la fibrinólisis o fibrinogenolisis inadecuadas, asociadas con circulación extracorpórea, cirrosis hepática, amiloidosis, leucemia promielocítica aguda, tumores sólidos y para bloquear la metástasis tumoral.

Inhibidores de la plasmina humana derivados de dominios Kunitz y acidos nucleicos que codifican los mismos ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Campo de la invencion Esta invención se refiere a nuevos mutantes del primer dominio Kunitz (K1) del inhibidor de coagulación asociado a lipoprotefnas LACI humano, que inhibe la plasmina. La invención tambien se refiere a otros dominios Kunitz modificados que inhiben la plasmina y a otros inhibidores de plasmina.

Descripcion de la tecnica anterior El agente principal responsable de la fibrin6lisis es la plasmina, la forma activada del plasmin6geno. Muchas sustancias pueden activar el plasmin6geno, incluyendo el factor Hageman activado, estreptoquinasa, uroquinasa (uPA) , activador del plasmin6geno de tipo tisular (tPA) , calicrefna plasmatica (pKA) . La pKA es tanto un activador de la forma de zim6geno de la uroquinasa como un activador directo de plasmin6geno.

La plasmina no se puede detectar en la sangre que circula normal, pero el plasmin6geno, el zim6geno, esta presente en una concentración de aproximadamente 3 IM. Una cantidad adicional, no medida, del plasmin6geno esta unida a fibrina y otros componentes de la matriz extracelular y superficies celulares. La sangre normal contiene el inhibidor fisiológico de la plasmina, el inhibidor de plasmina α2 (α2-PI) , en una concentración de aproximadamente 2 IM. La plasmina y el α2-PI forman un complejo 1:1. La plasmina unida a la matriz o a la celula esta relativamente inaccesible para la inhibición por el α2-PI. Por lo tanto, la activación de la plasmina puede superar la capacidad neutralizante del α2-PI produciendo un estado profibrinol6tico.

Una vez formada, la plasmina:

i. degrada los coagulos de fibrina, a veces de forma prematura;

ii. digiere el fibrin6geno (el material estructural de los coagulos) deteriorando la hemostasia produciendo la formación de coagulos disgregables y que son lisados facilmente a partir de los productos de degradación, y la inhibición de la adhesión/agregación de plaquetas por los productos de degradación del fibrin6geno;

iii. interacciona directamente con las plaquetas para escindir las glicoprotefnas Ib y IIb/IIIa impidiendo la adhesión al endotelio danado en zonas de flujo sangufneo de alta tensión de cizallamiento, y deteriorando la respuesta de agregación necesaria para la formación de tapones de plaquetas (ADEL86) ;

iv. inactiva enzimas proteolfticamente en la ruta de coagulación extrfnseca promoviendo ademas un 30 estado proteolftico.

Robbins (ROBB8?) revis6 con detalle el sistema de plasmin6geno-plasmina.

Fibrin6lisis y fibrinogenolisis La fibrin6lisis y fibrinogenolisis inadecuadas que conducen a la hemorragia excesiva son una complicación frecuente en los procedimientos quirurgicos que requieren circulación extracorp6rea, tal como la circulación extracorp6rea y tambien se encuentra en la terapia trombolftica y el trasplante de 6rganos, particularmente de hfgado. Otras afecciones clfnicas caracterizadas por una alta incidencia de diatesis hemorragica incluyen cirrosis hepatica, amiloidosis, leucemia promielocftica aguda y tumores sólidos. La restauración de la hemostasia requiere la infusión de plasma y/o productos del plasma, la cual tiene riesgo de reacciones inmunológicas y exposición a pat6genos, por ejemplo virus de la hepatitis y VIH.

Una perdida muy grande de sangre puede no resolverse incluso con infusión masiva. Cuando se considera potencialmente mortal, la hemorragia se trata con antifibrinolfticos tales como acido ε-amino-caproico (vease HOOV93) (EACA) , acido tranexamico o aprotonina (NEUH98) . La aprotonina tambien se conoce como Trasylol® y como inhibidor de la tripsina pancreatica bovina (BPTI) . En lo sucesivo, la aprotinina se denominara "BPTI". El EACA y el acido tranexamico sólo impiden la unión de la plasmina a la fibrina por unión a los kringles, dejando así a la 45 plasmina como una proteasa libre en el plasma. El BPTI es un inhibidor directo de la plasmina y es el mas eficaz de estos agentes. Debido a las potenciales complicaciones tromb6ticas, toxicidad renal, y en el caso del BPTI, inmunogenicidad, estos agentes se usan con precaución y normalmente se reservan como "ultimo recurso" (PUTT89) . Los tres agentes antifibrinolfticos carecen de especificidad y afinidad de objetivo, e interaccionan con tejidos y 6rganos por rutas metab6licas no caracterizadas. Las grandes dosis necesarias debido a la baja afinidad, 50 los efectos secundarios debidos a la falta de especificidad y la potencial reacción inmunitaria y toxicidad en

6rganos/tejidos, se unen contra el uso de estos antifibrinolfticos para la prevención profilactica de hemorragias o como terapia postoperatoria rutinaria, para evitar o reducir la terapia por transfusión. Por lo tanto, se necesita un antifibrinolftico seguro. Los atributos esenciales de dicho agente son:

i. Neutralización de la o las enzimas fibrinolfticas objetivo relevantes;

ii. Alta afinidad de unión a las enzimas objetivo para minimizar la dosis;

iii. Alta especificidad por el objetivo, para reducir los efectos secundarios; y iv. Alto grado de similitud con la protefna humana para minimizar la potencial inmunogenicidad y/o toxicidad en 6rganos/tejidos.

Todas las enzimas fibrinolfticas que son objetivos candidatos para la inhibición mediante un antifibrinolftico eficaz son serina proteasas hom6logas a la quimiotripsina.

Hemorragia excesiva La hemorragia excesiva puede ser el resultado de una actividad de coagulación deficiente, elevada actividad fibrinolftica, o una combinación de los dos procesos. En la mayorfa de las diatesis hemorragicas se debe controlar la actividad de la plasmina. Se cree que el efecto clfnico beneficioso del BPTI en la reducción de la perdida de sangre resulta de la inhibición de la plasmina (KD ∼ 0, 3 nM) o la calicrefna plasmatica (KD ∼ 100 nM) o ambas enzimas.

En GARD93 se revisan los trombolfticos actualmente usados, diciendo que aunque los agentes trombolfticos (por ejemplo, tPA) abren los vasos sangufneos, la hemorragia excesiva es un problema de seguridad grave. Aunque el tPA y la estreptoquinasa tienen semividas en el plasma cortas, la plasmina que activan permanece en el sistema durante un periodo de tiempo largo, y como se ha expuesto, el sistema es potencialmente deficiente en inhibidores de plasmina. Por lo tanto, la activación excesiva de plasmin6geno puede conducir a una incapacidad de coagular peligrosa y a hemorragias perjudiciales o mortales: en dichos casos serfa util un inhibidor de plasmina potente y altamente específico.

El BPTI es un inhibidor de plasmina potente, sin embargo, se ha encontrado que es suficientemente antfgeno para que los segundos usos requieran ensayo de la piel. Ademas, las dosis de BPTI necesarias para controlar la hemorragia son bastante altas y el mecanismo de acción no esta claro. Algunos dicen que el BPTI actua sobre la plasmina, mientras que otros dicen que actua inhibiendo la calicrefna del plasma. En FRAE89 se describe que dosis de aproximadamente 840 mg de BPTI a 80 pacientes de cirugfa a coraz6n abierto, redujeron la perdida de sangre en casi la mitad, y la cantidad media de transfusión disminuy6 en ?4%. Miles Inc. ha introducido recientemente el Trasylol en EE.UU. para reducir la hemorragia en cirugfa (vease el folleto del producto de Miles sobre el Trasylol) . En LOHM93 se sugiere que los inhibidores de plasmina pueden ser utiles para controlar la hemorragia en la cirugfa ocular. En SHER89 se describe que el BPTI puede ser util para limitar la hemorragia en la cirugfa de colon.

Un inhibidor de plasmina que es aproximadamente tan potente como el BPTI o mas potente, pero que es casi identico a un dominio de protefna humana, ofrece un potencial terapeutico similar, pero tiene menor potencial antigenico.

Angiogenesis:

La plasmina es la enzima clave en la angiogenesis. En OREI94 se describe que un fragmento de 38 kDa de la plasmina (que carece del dominio catalftico) es un potente inhibidor de la metastasis, indicando que la inhibición de la plasmina podrfa ser util para bloquear la metastasis de tumores (FIDL94) . Vease tambien ELLI92.

Plasmina La plasmina es una serina proteasa derivada del plasmin6geno. El dominio catalftico de la plasmina (o "CatDom") corta enlaces peptfdicos, en particular despues de restos de arginina y en menor medida despues de lisinas, y es altamente hom6logo a la tripsina, quimiotripsina,... [Seguir leyendo]

1. Uso de un polipeptido inhibidor de plasmina aislado que comprende una estructura de dominio Kunitz, que comprende una secuencia de aminoacido que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa?-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Gly-Xaa13-Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa1?

Xaa18-Xaa19-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa2?-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe-

Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa4?-Xaa48-Xaa49-

Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa5?-Xaa58, en la que cualquiera de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa5? o Xaa58 puede estar ausente;

Xaa10 se selecciona de Asp y Glu;

Xaa11 se selecciona de Thr, Ala y Ser;

Xaa13 es Pro;

Xaa15 es Arg;

Xaa16 es Ala;

Xaa1? es Arg;

Xaa18 es Phe;

Xaa19 se selecciona de Glu y Asp;

Xaa21 se selecciona de Phe y Trp;

Xaa22 se selecciona de Tyr y Phe;

Xaa23 se selecciona de Tyr y Phe;

Xaa31 se selecciona de Asp y Glu;

Xaa32 se selecciona de Thr, Ala y Glu;

Xaa34 se selecciona de Val, IIe y Thr;

Xaa35 es Tyr;

Xaa36 es Gly;

Xaa39 se selecciona de Glu, Gly y Asp;

Xaa40 se selecciona de Gly y Ala;

Xaa43 se selecciona de Asn y Gly; y Xaa45 se selecciona de Phe y Tyr, en la preparación de un medicamento para tratar la fibrin6lisis o fibrinogenolisis inadecuadas, asociadas con circulación extracorp6rea, cirrosis hepatica, amiloidosis, leucemia promielocftica aguda, tumores sólidos y para bloquear la metastasis tumoral.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipeptido inhibidor de plasmina comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipeptido inhibidor de plasmina comprende una secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 40.