Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA.

Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 que puede estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína Tat,

para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente.

Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA

La presente invención proporciona composiciones para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente humano, y una vacuna contra una infección por VIH.

Antecedentes técnicos:

La búsqueda de una vacuna contra el SIDA sigue siendo una cuestión principal desde el descubrimiento del VIH-1 (Barre-Sinoussi et al., 1983) . El fracaso de enfoques de vacuna clásicos que seleccionan como diana proteínas de la envuelta de VIH-1 señala el interés de usar otra diana tal como la proteína transactivadora de la transcripción de VIH-1 denominada Tat, debido a su función extracelular que implica el colapso de la respuesta inmunitaria celular contra células infectadas por VIH (Jeang et al., 1999) .

Tat existe predominantemente en dos longitudes diferentes, 86-87 residuos o 99-101 residuos, que presentan actividades polifacéticas (Jeang et al., 1999) . Las formas largas son predominantes en aislados clínicos de todos los subtipos de VIH-1 excepto el subtipo D, debido a la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido no sinónimo, que crea un codón de terminación en la secuencia que codifica para el segundo exón (Jeang et al., 1999) . Tat se divide en seis regiones (Kuppuswamy et al., 1989) con una denominada región básica que está implicada en la mayoría de las actividades de Tat. Estudios de RMN de variantes de Tat biológicamente activas revelaron que la región básica y las demás regiones funcionales están muy expuestas al disolvente y rodean un núcleo compuesto por parte del extremo N-terminal con el Trp 11 bien conservado (PéloponÃse et al., 2000; Gregoire et al., 2001, Watkins et al., 2008) . Entre diferentes variantes de Tat este plegamiento es similar en disolución acuosa pero puede cambiar drásticamente cuando se expone a un disolvente hidrófobo (PéloponÃse et al., 1999) . Tat es una proteína flexible y son necesarios cambios estructurales para que se una a sus dianas farmacológicas (Loret et al., 1992) .

Tat se encuentra principalmente en el núcleo de células infectadas donde funciona como activador transcripcional de actuación en trans (Wong-Staal et al, 1985; Fujisawa et al., 1985) , donde se sabe que está implicado en la iniciación de la transcripción y el alargamiento de la cadena de ARN (Cullen, 1990) mediante un proceso complejo que implica interacciones con proteínas celulares y un ARN líder en tallo-bucle de protuberancia, TAR (región sensible a transactivación) , en el ARNm viral y acetilación del Tat (Bres et al., 2002) . Estudios han mostrado que también participa en la transcripción inversa del ARN de VIH-1 (Harrich et al., 1997) .

A pesar de la falta de una secuencia señal, Tat es la única proteína de VIH-1 que va a secretarse por células infectadas por VIH-1 y se encuentra en niveles detectables en los sobrenadantes de cultivo de células infectadas por VIH-1 (0, 1 -1 ng/ml) (Ensoli et al., 1990; Westendorp et al., 1995b; Chang et al, 1997) y en los sueros de pacientes infectados por VIH-1 (1-40 ng/ml) (Xiao et al., 2000; Westendorp et al., 1995b) . Tat extracelular presenta actividades polifacéticas (Jeang et al., 1999) , pero la más importante es desencadenar la apoptosis de células T no infectadas atravesando la membrana celular, conduciendo a apoptosis a través de la ruta mitocondrial (Chen et al., 2002, Campbell et al., 2004, de Mareuil et al., 2005) . La neutralización de Tat extracelular in vivo en macacos expuestos a VIHS-1 induce un aumento de células T CD8+ y las células T CD4+ infectadas por VIH-1 se vuelven indetectables (Watkins et al., 2006) .

Por tanto, el papel de Tat en la patogénesis de VIH-1 es no sólo como una proteína esencial para la replicación de VIH-1 en células infectadas, sino también como toxina extracelular (Gallo, 1999) . Por tanto, es relevante desarrollar una vacuna que seleccione como diana Tat (Goldstein, 1996) . Sin embargo, pacientes seropositivos que tienen anticuerpos contra Tat no pueden reconocer variantes de Tat de todos los subtipos de VIH-1 (Campbell et al., 2007b) . Además, estos anticuerpos no pueden ralentizar la progresión de la enfermedad hasta SIDA (Senkaali et al., 2008) .

Queda claro que una vacuna contra Tat usando Tat del subtipo B encontrado principalmente en Europa y América del Norte tal como se propuso previamente (Goldstein, 1996, Zagur y et al., 1998, Cafaro et al., 1999) tiene una baja probabilidad de proporcionar un efecto terapéutico y preventivo contra la infección por VIH-1 en el resto del mundo y particularmente en Ã?frica. Además, una vacuna contra Tat usando Tat del subtipo B tiene también una baja probabilidad de proporcionar un efecto terapéutico y preventivo incluso en Europa y América del Norte debido a la incapacidad del sistema inmunitario para neutralizar Tat extracelular.

Las dos estrategias de vacuna principales contra Tat hasta ahora usan una versión corta, de 86 residuos de una variante de Tat europea del subtipo B que o bien está inactivada (Zagur y et al., 1998) o bien tiene actividad completa (Cafaro et al., 1999) . Estos dos enfoques se sometieron a prueba en macacos seguido por una exposición a VIHS-1 homólogo (Cafaro et al., 1999; Pauza et al., 2000) . Se observó una disminución significativa de la viremia en estos dos estudios llevados a cabo respectivamente en macacos cynomolgus (Cafaro et al., 1999) y rhesus (Pauza et al., 2000) , sin mostrar protección completa durante la primo-infección. Otro estudio mostró un control a largo plazo de la infección tras la exposición a VIHS-1 en macacos cynomolgus vacunados contra Tat (Maggiorella et al., 2004) . Estos estudios señalan que vacunas que usan Tat biológicamente activo parecen ser un enfoque seguro tal como se indica

por los estudios de seguridad llevados a cabo en monos en los que no se observaron efectos adversos o toxicidad sistémica o local (Cafaro et al., 1999, 2001; Caselli et al., 1999, Goldstein et al., 2000) .

Es interesante indicar que aparecen resultados contradictorios en estudios de vacunas contra Tat en macacos puesto que no se observó protección con una exposición a VIS (Allen et al., 2002) o una vacunación con un virus recombinante que codifica para una proteína Tat-Rev (Verrier et al., 2002) . Estos resultados contradictorios podrían explicarse por diferentes regímenes de inmunización, reservas virales, vías de exposición viral y especies animales. La diferencia entre Tat de VIS y Tat de VIH-1 en el primer estudio y la probabilidad de que una proteína recombinante Tat-Rev no tenga el plegamiento de Tat nativo o el plegamiento de Rev nativo para el segundo estudio pueden explicar la ausencia de protección. Sin embargo, más desconcertante es el resultado de otros dos estudios que usan vectores virales similares que expresan Tat, Env y Gag que proporcionan conclusiones opuestas. Un estudio muestra la eficacia de Tat vectorizado, pero no Gag y Env (Stittelaar et al., 2002) , mientras que otro estudio mostró la eficacia de Gag y Env vectorizados, pero no Tat (Liang et al., 2005) . La principal diferencia en los dos estudios es que uno está usando una exposición homóloga usando la secuencia de Tat Bru en tanto la vacuna como en el VIHS (Stittelaar et al., 2002) y el otro una exposición heteróloga con la secuencia de Tat Bru en la vacuna y Tat Jr en el VIHS (Liang et al., 2005) . VIH-1 Jr y VIH-1 Bru son subtipos B (figura 1) pero sus secuencias de Tat tienen mutaciones no conservativas que inducen cambios conformacionales (Gregoire & Loret., 1996) . Estas mutaciones entre la vacuna y el virus usados para la exposición podrían explicar la falta de eficacia de la vacuna vectorizada contra Tat en el segundo estudio (Liang et al., 2005) . Queda claro que el segundo estudio se asemeja más estrechamente a la realidad puesto que una persona vacunada no es probable que se exponga a una infección por virus homóloga, pero en ese caso, por qué se han usado Gag y Env homólogos (Liang et al., 2005) ?

A lo largo de los últimos 20 años, se han sometido a prueba estudios de vacunas contra VIH-1 que seleccionan como diana las proteínas de la envuelta de VIH-1 usando un modelo de macaco/VIHS homólogo y han tenido éxito (Feinberg et al., 2002) . Sin embargo, los ensayos clínicos no eran satisfactorios (Vanichseni et al., 2004) . Esto se debe a la alta diversidad genética de VIH-1 y esto es por lo que debe usarse una exposición con VIHS heteróloga en macacos, con un virus genéticamente distinto, para determinar si una vacuna puede ser eficaz contra la infección por VIH-1 en seres humanos (Feinberg et al., 2002) . Si una exposición con VIHS homóloga satisfactoria es útil para mostrar el interés de la vacunación contra Tat in vivo, el desarrollo... [Seguir leyendo]

1. Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 que puede estimular una respuesta inmunitaria contra una proteína Tat, para su uso en la prevención o el tratamiento del síndrome de 5 inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en un paciente.

2. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según la reivindicación 1, en la que puede estimular una respuesta inmunitaria contra dos, tres, cuatro o más subtipos de VIH-1, preferiblemente en la que puede estimular una respuesta inmunitaria contra cinco subtipos de VIH-1.

3. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según la reivindicación 1, en la que i) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; o ii) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 truncada de 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo N

terminal; o iii) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 truncada de 1 a 14 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos en el extremo C-terminal.

4. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según las reivindicaciones 1

a 3, en la que la proteína puede estimular una respuesta inmunitaria contra proteínas Tat de dos, tres, cuatro, cinco o más subtipos de VIH-1 seleccionados de A, B, C, D, E, F, G, H, J y K.

5. Proteína para su uso en la prevención o el tratamiento del SIDA en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína es una proteína sintetizada químicamente, o es una proteína 25 recombinante.

6. Composición farmacéutica que comprende una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la proteína es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso como vacuna profiláctica o terapéutica contra una infección por VIH-1.

9. Composición farmacéutica que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso como vacuna profiláctica o terapéutica contra una infección por VIH, preferiblemente una infección por VIH-1.

11. Vacuna que comprende como principio activo una proteína Tat Oyi de transactivación competente que comprende una cisteína en la posición 22.

12. Vacuna según la reivindicación 11, en la que la proteína se selecciona de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

13. Vacuna según la reivindicación 11 ó 12, que comprende además un adyuvante.

14. Proteína que comprende al menos una de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y un adyuvante, para su uso en la inmunización de animales de sangre caliente mediante inyección.