Producción de glucocerebrosidasa humana con alto contenido de manosa en cultivo vegetal.

Una proteína glucocerebrosidasa (GCD) humana que tiene actividad catalítica de la glucocerebrosidasa ligada demanera contigua en su terminal C a un péptido señal de direccionamiento vacuolar que consiste en la SEC ID Nº:

2,en donde dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosa expuesta,en donde dicha proteína GCD humana comprende además al menos una fucosa que tiene un enlace alfa (1-3)-glucosídico y al menos una xilosa, y en donde la proteína GCD humana no está codificada por la SEC ID Nº: 7.

Producción de glucocerebrosidasa humana con alto contenido de manosa en cultivo vegetal

Campo de la invención La presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosómico más frecuente. Está provocado por un trastorno genético recesivo (cromosoma 1 q21-q31) que produce una deficiencia de glucocerebrosidasa, también conocida como glucosilceramidasa, que es una enzima lisosómica unida a la membrana que cataliza la hidrólisis del glucoesfingolípido glucocerebrósido (glucosilceramida, GlcCer) en glucosa y ceramida. La enfermedad de Gaucher

se produce por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA) , que generan la acumulación de GlcCer en los lisosomas de los macrófagos. Las células de almacenamiento características, denominadas células de Gaucher, se encuentran en el hígado, el bazo y la médula ósea. Los síntomas clínicos asociados incluyen hepatoesplenomegalia grave, anemia, trombocitopenia y deterioro esquelético.

El gen que codifica la GCD humana fue secuenciado por primera vez en 1985 (6) . La proteína consiste en 497 aminoácidos derivados de un pro-péptido 536-mero. La hGCD madura contiene cinco secuencias consenso de aminoácidos de N-glucosilación (Asn-X-Ser/Thr) . Cuatro de estos sitios normalmente están glucosilados. La glucosilación del primer sitio es esencial para la producción de proteína activa. Se han identificado cadenas de oligosacáridos tanto con alto contenido de manosa como complejas (7) . La hGCD de placenta contiene un 7 % de hidrato de carbono, 20 % del cual es del tipo con alto contenido de manosa (8) . Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida han proporcionado un mapa inicial de regiones y restos importantes para el plegamiento, la interacción de activadores y la localización de sitios activos (9) .

El tratamiento de hGCD placentaria con neuraminidasa (produciendo una enzima asialo) produce un aumento de las tasas de eliminación y captación por células de hígado de rata con un aumento concomitante de la actividad enzimática hepática (Furbish et al., 1981, Biochim. Biophys. Acta 673:425-434) . Esta hGC placentaria modificada con glucanos se usa actualmente como agente terapéutico en el tratamiento de enfermedad de Gaucher. Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida han proporcionado un mapa inicial de las regiones y los restos importantes para el plegamiento, la interacción de activadores y la localización de sitios activos [Grace et al., J. Biol.

Chem. 269:2283-2291 (1994) ].

Hay tres tipos diferentes de enfermedad de Gaucher, cada uno de los cuales está determinado por el nivel de actividad de hGC. Las principales células afectadas por la enfermedad son los macrófagos, que se agrandan enormemente debido a la acumulación de GlcCer y, por tanto, se denominan “células de Gaucher”.

La identificación de un defecto en la GCD como causa primaria de la enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de la terapia de sustitución de enzimas como estrategia terapéutica para este trastorno.

De Duve sugirió primero que el reemplazo de la enzima lisosómica ausente por enzima exógena biológicamente 45 activa podría ser un enfoque viable para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico [Fed Proc. 23:1045 (1964) ].

Desde entonces, diversos estudios han sugerido que la terapia de sustitución de enzimas puede ser beneficiosa para tratar diversas enfermedades de almacenamiento lisosómico. El mayor éxito se ha mostrado en los individuos con la enfermedad de Gaucher de tipo I que se trataron con enzima exógena (º-glucocerebrosidasa) , preparada a partir de placenta (Ceredasa™) o, más recientemente, recombinantemente (Cerezyme™) .

La glucocerebrosidasa sin modificar de origen natural es una glucoproteína con cuatro cadenas de hidratos de carbono. Esta proteína no se dirige a las células fagocíticas del organismo y, por tanto, tiene un valor terapéutico 55 limitado. En el desarrollo de la presente terapia contra la enfermedad de Gaucher, los azúcares terminales de las cadenas de hidratos de carbono de la glucocerebrosidasa se eliminan secuencialmente mediante el tratamiento con tres glucosidasas diferentes. Este tratamiento con glucosidasa produce una glucoproteína cuyos azúcares terminales consisten en restos de manosa. Como los fagocitos tienen receptores de manosa que reconocen las glucoproteínas y los glucopéptidos con cadenas de oligosacáridos que terminan en restos de manosa, la remodelación de los hidratos de carbono de la glucocerebrosidasa ha mejorado la dirección de la enzima hacia estas células [Furbish et al., Biochem. Biophys. Acta 673:425, (1981) ].

Como se indica en el presente documento, la glucosilación desempeña un papel crucial en la actividad de la hGCD; por tanto, la desglucosilación de hGCD expresada en líneas celulares usando tanto tunicamicina (células Sf9) como 65 mutaciones puntuales que suprimen todos los sitios de glucosilación (tanto células Sf9 como COS-1) produce la pérdida completa de la actividad enzimática. Además, se encontró que la hGCD expresada en E. coli era inactiva.

Investigaciones posteriores indicaron la relevancia de los diversos sitios de glucosilación para la actividad proteica. Además del papel de la glucosilación en la presente actividad proteica, la enzima producida a nivel comercial contiene modificaciones en las secuencias de glucano que facilitan la administración de un determinado fármaco. Las proteínas glucosiladas son remodeladas tras su extracción para incluir solamente secuencias de glucano que contienen manosa.

La enzima GCD humana contiene 4 sitios de glucosilación y 22 lisinas. La enzima recombinantemente producida (Cerezyme™) se diferencia de la enzima placentaria (Ceredasa™) en la posición 495, en la que una arginina ha sido sustituida con una histidina. Además, la composición del oligosacárido es diferente entre la GCD recombinante y la 10 placentaria, ya que la primera tiene más restos de fucosa y N-acetil-glucosamina, mientras que la última conserva una cadena con alto contenido de manosa. Como se ha mencionado anteriormente, ambos tipos de GCD se tratan con tres glucosidasas diferentes (neuraminidasa, galactosidasa y P-N acetil-glucosaminidasa) para exponer las manosas terminales, lo que permite dirigirse a las células fagocíticas. En el documento US 5.549.892, se describe una preparación farmacéutica que comprende la enzima recombinantemente producida. Cabe señalar que todas las referencias mencionadas se incorporan en el presente documento por referencia como si se expusieran en su totalidad en el presente documento.

Un inconveniente asociado al tratamiento con terapia de sustitución de enzima lisosómica existente es que la bioactividad in vivo de la enzima es indeseablemente baja, por ejemplo, debido a la baja captación, reducida dirección a los lisosomas de las células específicas en las que se acumula el sustrato y una corta semivida in vivo funcional en los lisosomas.

Otro inconveniente importante de las enzimas recombinantes de GCD existentes es su gasto, que puede ser una gran carga económica para los sistemas de atención sanitaria. El alto coste de estas enzimas recombinantes se debe a un complejo protocolo de purificación y a las cantidades relativamente elevadas del agente terapéutico requeridas para los tratamientos existentes. Existe, por tanto, la necesidad urgente de reducir el coste de la GCD de manera que esta terapia que salva vidas se pueda proporcionar de una manera más asequible a todos los que la necesitan.

Las proteínas para un uso farmacéutico se han producido tradicionalmente en sistemas de expresión de mamífero o bacterianos. En la década pasada, se desarrolló un nuevo sistema de expresión en plantas. Esta metodología utiliza agrobacterias, bacterias que pueden insertar moléculas de ADN monocatenario (T-ADN) en el genoma de las plantas. Debido a la relativa simplicidad de la introducción de genes para la producción a escala industrial de proteínas y péptidos, esta metodología cada vez es más popular como un sistema de expresión de proteínas alternativo (1) .

Aunque las modificaciones postraduccionales no existen en sistemas de expresión bacterianos, los sistemas de expresión derivados de plantas facilitan estas modificaciones que se sabe que son cruciales para la expresión y actividad de las proteínas. Una de las principales diferencias entre el sistema de expresión de proteínas de mamífero y de plantas es la variación de las cadenas laterales de azúcar de las proteínas, producidas por las diferencias... [Seguir leyendo]

1. Una proteína glucocerebrosidasa (GCD) humana que tiene actividad catalítica de la glucocerebrosidasa ligada de manera contigua en su terminal C a un péptido señal de direccionamiento vacuolar que consiste en la SEC ID Nº: 2,

en donde dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosa expuesta, en donde dicha proteína GCD humana comprende además al menos una fucosa que tiene un enlace alfa (1-3) glucosídico y al menos una xilosa, y en donde la proteína GCD humana no está codificada por la SEC ID Nº: 7.

2. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicha proteína GCD humana está codificada por la SEC ID Nº: 13. 10

3. La proteína de la reivindicación 1 o 2, que está aislada.

4. Una composición farmacéutica que comprende la proteína glucocerebrosidasa humana de una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 15

5. Una célula vegetal que expresa la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1 o 2.

6. La célula vegetal de la reivindicación 5, en donde dicha célula vegetal es una célula de zanahoria.

7. La célula vegetal de la reivindicación 5 o 6, en donde la estructura de glucano principal de dicha proteína glucocerebrosidasa de dicha célula vegetal comprende dicha manosa expuesta.

8. Una composición farmacéutica que comprende células vegetales de la reivindicación 5 o 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25

9. Una proteína glucocerebrosidasa humana que tiene actividad catalítica de la glucocerebrosidasa ligada de manera contigua en su terminal C a un péptido señal de direccionamiento vacuolar que consiste en la SEC ID Nº: 2, en donde dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosa expuesta, en donde dicha proteína GCD humana comprende además al menos una fucosa que tiene un enlace alfa (1-3)

glucosídico y al menos una xilosa, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o la proteína glucocerebrosidasa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 formulada para la administración oral.

11. La célula vegetal de la reivindicación 6, en donde dicha célula vegetal es una célula de zanahoria cultivada en suspensión.

Remodelación de glucano con glucosidasas