Glucocerebrosidasa con alto contenido y de manosa y su producción en cultivo vegetal.

Una proteína glucocerebrosidasa humana que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº:

7, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosaexpuesta, al menos una fucosa que tiene un enlace alfa(1-3)-glucosídico y al menos una xilosa, y está ligada en suextremo C a un péptido señal que elige dianas vacuolares como se expone en SEC ID Nº: 2.

Glucocerebrosidasa con alto contenido de manosa y su producción en cultivo vegetal

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones según se caracterizan en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosómico más frecuente. Se produce por un trastorno genético recesivo (cromosoma 1 q21-q31) que produce deficiencia de glucocerebrosidasa, también conocida como glucosilceramidasa, que es una enzima lisosómica unida a la membrana que cataliza la hidrólisis del glucoesfingolípido glucocerebrósido (glucosilceramida, GlcCer) a glucosa y ceramida. La enfermedad de Gaucher se produce por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA) , que producen acumulación de GlcCer en los lisosomas de macrófagos. Las células de almacenamiento características, llamadas células de Gaucher, se encuentran en el hígado, el bazo y la médula ósea. Los síntomas clínicos asociados incluyen hepatoesplenomegalia grave, anemia, trombocitopenia y deterioro esquelético.

El gen que codifica GCD humana fue secuenciado por primera vez en 1985 (6) . La proteína consiste en 497 aminoácidos derivados de un pro-péptido 536-mero. La hGCD madura contiene cinco secuencias consenso de aminoácidos de N-glucosilación (Asn-X-Ser/Thr) . Cuatro de estos sitios están normalmente glucosilados. La glucosilación del primer sitio es esencial para la producción de proteína activa. Se han identificado cadenas de oligosacáridos tanto con alto contenido de manosa como complejas (7) . La hGCD de placenta contiene 7% de hidrato de carbono, 20% del cual es del tipo con alto contenido de manosa (8) . Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida a sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción de activadores y localización de sitios activos (9) .

El tratamiento de hGCD placentaria con neuraminidasa (dando una asialo-enzima) produce un aumento de las tasas de eliminación y captación por células de hígado de rata con un aumento concomitante en actividad enzimática hepática (Furbish y col., 1981, Biochim. Biophys. Acta 673:425-434) . Esta hGC placentaria modificada con glucanos se usa actualmente como agente terapéutico en el tratamiento de enfermedad de Gaucher. Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida a sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción de activadores y localización de sitios activos [Grace y col., J. Biol. Chem. 269:2283-2291 (1994) ].

Hay tres tipos diferentes de enfermedad de Gaucher, cada uno determinado por el nivel de actividad de hGC. Las principales células afectadas por la enfermedad son los macrófagos, que se agrandan altamente debido a la acumulación de GlcCer y, por tanto, se denominan “células de Gaucher”.

La identificación de un defecto en GCD como causa primaria de la enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de terapia de sustitución de enzimas como estrategia terapéutica para este trastorno.

De Duve sugirió primero que la sustitución de la enzima lisosómica ausente con enzima exógena biológicamente activa podría ser un enfoque viable para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico [Fed Proc. 23:1045 (1964) ].

Desde entonces, diversos estudios han sugerido que la terapia de sustitución de enzimas puede ser beneficiosa para tratar diversas enfermedades de almacenamiento lisosómico. El mejor éxito se ha mostrado con individuos con enfermedad de Gaucher de tipo I que se trataron con enzima exógena (β-glucocerebrosidasa) , preparada a partir de placenta (Ceredasa™) o, más recientemente, recombinantemente (Cerezyme™) .

La glucocerebrosidasa sin modificar derivada de fuentes naturales es una glucoproteína con cuatro cadenas de hidratos de carbono. Esta proteína no elige como diana las células fagocíticas en el cuerpo y, por tanto, es de valor terapéutico limitado. En el desarrollo de la presente terapia para enfermedad de Gaucher, los azúcares terminales en las cadenas de hidratos de carbono de glucocerebrosidasa se eliminan secuencialmente mediante tratamiento con tres glucosidasas diferentes. Este tratamiento con glucosidasa produce una glucoproteína cuyos azúcares terminales consisten en residuos de manosa. Como los fagocitos tienen receptores de manosa que reconocen glucoproteínas y glucopéptidos con cadenas de oligosacáridos que terminan en residuos de manosa, la remodelación de hidratos de carbono de glucocerebrosidasa ha mejorado la elección como diana de la enzima para estas células [Furbish y col., Biochem. Biophys. Acta 673:425, (1981) ].

Como se indica en el presente documento, la glucosilación desempeña una función crucial en la actividad de hGCD; por tanto, la desglucosilación de hGCD expresada en líneas celulares usando tanto tunicamicina (células Sf9) como mutaciones puntuales que abolen todos los sitios de glucosilación (tanto células Sf9 como COS-1) produce la pérdida completa de actividad enzimática. Además, se encontró que la hGCD expresada en E. coli era inactiva. Más investigación indicó la significancia de los diversos sitios de glucosilación para la actividad de proteína. Además de la función de glucosilación en la presente actividad de proteína, la enzima comercialmente producida contiene

modificaciones de secuencias de glucano que facilitan la administración específica de fármaco. Las proteínas glucosiladas son remodeladas tras la extracción para incluir sólo manosa que contiene secuencias de glucano.

La enzima GCD humana contiene 4 sitios de glucosilación y 22 lisinas. La enzima recombinantemente producida (Cerezyme™) se diferencia de la enzima placentaria (Ceredasa™) en la posición 495 en la que una arginina ha sido sustituida con una histidina. Además, la composición del oligosacárido se diferencia entre la GCD recombinante y la placentaria ya que la primera tiene más residuos de fucosa y N-acetil-glucosamina mientras que la última retiene una cadena con alto contenido de manosa. Como se menciona anteriormente, ambos tipos de GCD se tratan con tres glucosidasas diferentes (neuraminidasa, galactosidasa y P-N acetil-glucosaminidasa) para exponer manosas terminales, que permite elegir como diana células fagocíticas. Una preparación farmacéutica que comprende la enzima recombinantemente producida se describe en el documento US 5.549.892. Debe observarse que todas las referencias mencionadas se incorporan por este documento por referencia como si se expusieran completamente en el presente documento.

Un inconveniente asociado al tratamiento con terapia de sustitución de enzima lisosómica existente es que la bioactividad in vivo de la enzima es indeseablemente baja, por ejemplo, debido a la baja captación, reducida elección como diana de lisosomas de las células específicas en las que se acumula el sustrato y una corta semivida in vivo funcional en los lisosomas.

Otro inconveniente importante de las terapias de enzimas recombinantes de GCD existentes es su gasto, que puede ser una gran carga económica para los sistemas sanitarios. El alto coste de estas enzimas recombinantes resulta de un complejo protocolo de purificación y de las cantidades relativamente grandes del agente terapéutico requeridas para los tratamientos existentes. Por tanto, hay una necesidad urgente de reducir el coste de GCD de manera que esta terapia que salva vidas pueda proporcionarse más asequiblemente a todos los que la requieran.

Las proteínas para uso farmacéutico se han producido tradicionalmente en sistemas de expresión de mamífero o bacterianos. En la pasada década se desarrolló un nuevo sistema de expresión en plantas. Esta metodología utiliza Agrobacterium, una bacteria que puede insertar moléculas de ADN monocatenarias (T-ADN) en el genoma de la planta. Debido a la relativa simplicidad de introducir genes para la producción a escala industrial de proteínas y péptidos, esta metodología está siendo cada vez más popular como un sistema de expresión de proteínas alternativo (1) .

Aunque las modificaciones postraduccionales no existen en sistemas de expresión bacterianos, los sistemas de expresión derivados de plantas facilitan estas modificaciones que se sabe que son cruciales para la expresión y actividad de proteínas. Una de las principales diferencias entre el sistema de expresión de proteínas de mamífero... [Seguir leyendo]

1. Una proteína glucocerebrosidasa humana que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 7, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está glucosilada y comprende al menos una manosa expuesta, al menos una fucosa que tiene un enlace alfa (1-3) -glucosídico y al menos una xilosa, y está ligada en su

extremo C a un péptido señal que elige dianas vacuolares como se expone en SEC ID Nº: 2.

2. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa humana está ligada en su extremo N a un péptido señal de retículo endoplasmático.

3. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 2, en la que dicho péptido señal de retículo endoplasmático es como se expone en SEC ID Nº: 1.

4. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 3 que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 14.

5. La proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1, en la que dicha proteína glucocerebrosidasa es una proteína aislada.

6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1 y un 15 vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una célula vegetal que expresa la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 1.

8. Una célula vegetal que expresa la proteína glucocerebrosidasa humana de la reivindicación 2.

9. La célula vegetal de la reivindicación 7, en la que dicha célula vegetal es una célula de zanahoria.

10. La célula vegetal de la reivindicación 8, en la que dicha célula vegetal es una célula de zanahoria.

11. La célula vegetal de la reivindicación 7 u 8, en la que la estructura de glucano principal de dicha proteína glucocerebrosidasa de dicha célula vegetal comprende manosa expuesta.

12. Una composición farmacéutica para administración por vía oral que comprende células vegetales de la reivindicación 7 u 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que dichas células vegetales son células de 25 zanahoria.

14. Uso de la composición farmacéutica como se define por la reivindicación 12 ó 13 para el tratamiento de enfermedad de Gaucher por administración por vía oral.