Producción de alfa-galactosidasa A humana.

Un método de producción de α-Gal A humano purificado, que comprende ( a) cultivar una célula humana por ingeniería genética modificada para sobreexpresar y secretar α

-Gal A humano en un medio , ( b) recoger el medio que comprende el α-Gal A humano a partir de dichas células cultivadas , y (c ) purificar α-Gal A humano a partir del medio por (i ) pasar el medio a través de una resina de interacción hidrófoba y eluyendo α-Gal A humano de la resina , y (ii ) hacer pasar el α-Gal A humano eluido sobre columnas que contienen una resina de heparina inmovilizada, hidroxiapatito , una resina de intercambio de aniones y una resina de exclusión de tamaño y eluyendo α-Gal A humano purificado de la columna final, donde el α-Gal A humano purificado este libre de agentes de afinidad de lectina proteica y agentes análogos de sustrato de α-Gal A.

Produccion de a-galactosidasa A humana.

Esta invencion se refiere a la a-galactosidasa A y el tratamiento para la deficiencia de a galactosidasa A. [0002] La enfermedad de Fabr y es una enfermedad de deposito lisosomal hereditaria ligada al cromosoma X que se caracteriza por sintomas tan graves como insuficiencia renal, angioqueratomas y anomalias cardiovasculares, incluyendo la dilatacion ventricular y la insuficiencia de la valvula mitral. La enfermedad tambien afecta al sistema nervioso periferico, provocando episodios de dolor ardiente agonicos en las extremidades. La enfermedad de Fabr y es causada por una deficiencia en la enzima a-galactosidasa A (a-gal A) , lo que resulta en un bloqueo del catabolismo de los glicoesfingolipidos neutros y la acumulacion del sustrato de la enzima trihexosido ceramida dentro de las celulas y en el torrente sanguineo. [0003] Debido al patron de herencia ligada al cromosoma X de la enfermedad, esencialmente todos los pacientes de la enfermedad de Fabr y son hombres. Aunque se han observado unos heterocigotos hembras gravemente afectados, los heterocigotos hembras son generalmente asintomaticos o tienen sintomas relativamente leves limitados en gran medida a una opacidad caracteristica de la cornea. Una variante atipica de la enfermedad de Fabr y , exhibiendo actividad a-gal A residual baja y, o bien sintomas muy leves o aparentemente sin otros sintomas caracteristicos de la enfermedad de Fabr y , se correlaciona con la hipertrofia ventricular izquierda y enfermedad cardiaca (Nakano et al., Nueva Ingl. J. Med. 333:288-293, 1995) . Se ha especulado que la reduccion de a-gal A puede ser la causa de tales anomalias cardiacas. [0004] El ADNc y la codificacion del gen humano a-gal A se han aislado y secuenciado (Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 83:4859, 1986; Kornreich y col, Nuc. Acids Res. 17:3301, 1988; Oeltjen et al, Genoma mamifero 6: 335-338, 1995) . El a-gal A humano se expresa como un polipeptido de 429-aminoacidos, de los cuales el N-terminal de 31 aminoacidos constituye un peptido seral. La enzima humana se ha expresado en las celulas de ovario de hamster chino (CHO) (Desnick, patente de EE.UU. N 0 5.356.804; Ioannou et al., J. Cell Biol. 119:1137, 1992) ; celulas de insecto (Calhoun et al, Patente de EE.UU. No. 5.179.023) ; y celulas COS (Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 165:275, 1987) . Se ha informado de pruebas piloto de terapias de reemplazo de a-gal A, utilizando proteinas derivadas de tejidos humanos (Mapes et al.Science 169:987, 1970; Brady et al, N. Ingl. J. Med. 289:9, 1973; Desnick et al, Proc. Natl. Acad. Ciencia EE.UU. 76:5326, 1979) , pero actualmente no hay tratamiento efectivo para la enfermedad de Fabr y . Resumen de la invencion [0005] Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un metodo de produccion de a-gal A humano purificado, comprendiendo (a) cultivar una celula humana modificada por ingenieria genetica para sobreexpresar y secretar agal A humano en un medio, (b) recoger el medio que comprende el a-gal A humano a partir de dichas celulas cultivadas, y (c) purificar a-gal A humano del medio por (i) pasar el medio a traves de una resina de interaccion hidrofoba y eluyendo a-gal A humano de la resina, y (ii) pasar el a-gal A humano que se eluyo por columnas que contienen una resina de heparina inmovilizada, hidroxiapatita, una resina de intercambio anionico y una resina de exclusion de tamaro y eluyendo a-gal A humano purificado de la columna final, en la que el a-gal A humano purificado este libre de agentes de afinidad de lectina proteica y agentes analogos de sustrato a-gal A. [0006] La invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende un a-gal A humano purificado de enzima glicosilada para su uso en terapia de reemplazo enzimatico en una deficiencia en a-gal A, en la que dicha composicion este libre de (i) agentes de afinidad de lectina proteinaceas y (ii) agentes analogicos de sustrato de a-gal A. [0007] Se ha encontrado que la expresion de un ADN que codifica a-gal A humano en las celulas humanas cultivadas produce un polipeptido que esta glicosilado adecuadamente, de modo que no es solo enzimaticamente activo y capaz de actuar sobre el sustrato glicoesfingolipido que se acumula en la enfermedad de Fabr y , sino que tambien es internalizado eficazmente por las celulas a traves de receptores de la superficie celular que apuntan exactamente a donde se necesita en esta enfermedad: el compartimiento lisosomal de las celulas afectadas, particularmente las celulas endoteliales que recubren los vasos sanguineos del paciente. Este descubrimiento, que se analiza con mas detalle mas adelante, significa que un individuo sospechoso de tener una deficiencia de a-gal A tal como la enfermedad de Fabr y , puede ser tratado con a-gal A humano purificado obtenido a partir de celulas humanas cultivadas modificadas geneticamente. [0008] Cuando las celulas se van a modificar geneticamente para los fines de tratamiento de la enfermedad de Fabr y por la terapia de reemplazo de la enzima, una molecula de ADN que contiene un ADNc de a-gal A o una secuencia de ADN genomico puede estar contenida dentro de una construccion de expresion e introducida en celulas humanas primarias o secundarias (por ejemplo, fibroblastos, celulas epiteliales incluyendo celulas mamarias y celulas epiteliales intestinales, celulas endoteliales, elementos formados de la sangre incluyendo linfocitos y celulas de la medula osea, celulas gliales, hepatocitos, queratinocitos, celulas musculares, celulas neurales o los precursores de estos tipos de celulas) por metodos de transfeccion estandar, incluyendo, pero no limitados a, liposomas, polibreno, o transfeccion mediada por dextrano DEAE, electroporacion , precipitacion con fosfato de calcio, microinyeccion, o microproyectiles impulsados por velocidad (nbiolistican) . Alternativamente, se podria usar un sistema que proporcione ADN mediante un vector viral. Los virus conocidos por ser utiles para la transferencia genica incluyen adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes, virus de las paperas, virus de la polio, retrovirus, virus Sindbis y virus de vaccinia tales como el virus de la viruela del canario.

Tambien se pueden utilizar celulas humanas inmortalizadas. Ejemplos de lineas celulares humanas inmortalizadas utiles en los presente metodos incluyen, pero no se limitan a, celulas de melanoma de Bowes (N0 de Acceso ATCC CRL 9607) , celulas Daudi (N 0 de Acceso ATCC CCL 213) , celulas HeLa y derivados de celulas HeLa (N0 de Acceso ATCC CCL 2, CCL 2.1, y CCL 3 2.2) , celulas HL-60 (N0 de Acceso ATCC CCL 240 ) , celulas HT1080 (N0 Acceso ATCC CCL 121) , celulas Jurkat (N 0 de acceso ATCC TIB 152) , celulas de carcinoma KB (N0 de Acceso ATCC CCL 17) , celulas de leucemia K - 562 (N0 de Acceso ATCC CCL 243) , celulas de cancer de mama MCF-7 (N 0 de Acceso ATCC BTH 22) , celulas MOLT-4 8 (No. de Acceso ATCC 1582) , celulas Namalwa (N0 de Acceso ATCC CRL 1432) , celulas Raji (N0 de Acceso ATCC CCL 86) , celulas RPMI 8226 (N 0 de Acceso ATCC CCL 155) , celulas U-937 (N 0 de Acceso ATCC CRL 1593) , celulas 2R4 sublinea WI -38VA13 (N0 de Acceso ATCC CLL 75.1) , y celulas de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res. 48:5927-5932, 1988) , asi como celulas de heterohibridoma producidas por fusion de celulas humanas y celulas de otras especies . Cepas de fibroblastos humanos secundarios, tales como WI-38 (No. de Acceso ATCC CCL 75) y tambien se pueden usar MRC-5 (N 0 de Acceso ATCC CCL 171) .

Siguiendo la ingenieria genetica de celulas humanas con una molecula de ADN que codifica a-gal A (o siguiendo otra modificacion genetica adecuada, tal como se describe mas adelante) para producir una celula que sobreexprese y secrete a-gal A, una cepa celular clonal que consiste esencialmente en una pluralidad de celulas humanas primarias cultivadas geneticamente identicas o, donde las celulas sean inmortalizadas; puede generarse una linea celular clonal que consista esencialmente en una pluralidad de celulas humanas inmortalizadas geneticamente identicas. Preferiblemente, las celulas de la cepa celular clonal o linea celular clonal son fibroblastos.

El metodo de la invencion no depende de la posible disponibilidad inconsistente de fuentes de tejidos apropiadas y por tanto es un medio comercialmente viable de tratamiento de la deficiencia de a-gal A. Es relativamente libre de riesgo en comparacion con la terapia de reemplazo de enzima con enzimas derivadas de tejidos humanos que pueden estar infectados con virus conocidos o desconocidos y con otros agentes infecciosos.

Como se describio anteriormente, los individuos con deficiencias de a-gal A se pueden tratar con a-gal A purificado (es decir, terapia de reemplazo de enzima) . Las celulas humanas primarias, secundarias o inmortalizadas modificadas geneticamente para sobreexpresar a-gal A humano seran utiles para... [Seguir leyendo]

. Un metodo de produccion de a-Gal A humano purificado, que comprende ( a) cultivar una celula humana por ingenieria genetica modificada para sobreexpresar y secretar a-Gal A humano en un medio , ( b) recoger el medio que comprende el a-Gal A humano a partir de dichas celulas cultivadas , y (c ) purificar a-Gal A humano a partir del medio por (i ) pasar el medio a traves de una resina de interaccion hidrofoba y eluyendo a-Gal A humano de la resina , y (ii ) hacer pasar el a-Gal A humano eluido sobre columnas que contienen una resina de heparina inmovilizada, hidroxiapatito , una resina de intercambio de aniones y una resina de exclusion de tamaro y eluyendo a-Gal A humano purificado de la columna final, donde el a-Gal A humano purificado este libre de agentes de afinidad de lectina proteica y agentes analogos de sustrato de a-Gal A.

. El metodo de la reivindicacion 1 , en el que la celula ha sido transfectada con una molecula de ADN que codifica a-Gal A humano.

. El metodo de la reivindicacion 1 , en el que la celula ha sido transfectada con una molecula de ADN que comprende un elemento regulador que controla la expresion de la secuencia codificante para el a-Gal A.

. El metodo de la reivindicacion 1 , en donde la celula se modifica por la activacion de genes para expresar a-Gal

A.

. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 , en el que la celula es de fibroblastos .

. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 , en el que la celula es una celula primaria .

. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 , en el que la celula es una celula secundaria .

. El metodo de la reivindicacion 5 en el que el a-Gal A humano purificado tiene una actividad especifica de 2, 2 -2, 9 x 106 unidades / mg de proteina .

. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en el que pasar el medio a traves de una resina de interaccion hidrofoba constituye el primer paso de cromatografia durante la purificacion .

. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes , en el que el resto funcional de la resina de interaccion hidrofoba comprende un grupo butilo .

. Una composicion farmaceutica que comprende una enzima de a-Gal A humano purificado glicosilada para su uso en terapia de reemplazo de la enzima en una deficiencia de a-Gal A, en el que dicha composicion este libre de

(i) agentes de afinidad a la lalectina proteinacea y ( ii) agentes analogicos sustratos de a-Gal A .

. La composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11 , en la que dicha enzima es modificada por la sialilacion .

. La composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11 o 12 , en la que dicha enzima contiene manosa-6 - fosfato en sus oligosacaridos ligados a N.

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la reivindicacion 11 , en la que el a-Gal A humano es internalizado por celulas a traves de la manosa o el receptor de manosa -6 - fosfato .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14 , que comprende ademas un cargador aceptable farmaceutico, en la que la composicion tiene un pH inferior a 6, 5 .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15 , que comprende ademas un excipiente farmaceuticamente aceptable .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la reivindicacion 16 , en la que el excipiente se selecciona de un tampon , un aminoacido , urea , un alcohol , acido ascorbico , un fosfolipido , una proteina , EDTA , cloruro de sodio , liposomas , polivinilpirrolidona , manitol , sorbitol, glicerol , propilenglicol y polietilenglicol ( PEG ) .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la reivindicacion 17 , en la que el tampon se selecciona de tampon de citrato , tampon de fosfato , tampon de acetato y tampon de bicarbonato .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la reivindicacion 17 , en l que la proteina se selecciona a partir de suero de albumina y gelatina .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la reivindicacion 17 , en la que el PEG se selecciona a partir de PEG - 4000 y PEG -6000 .

. La composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-20 , en la que la enzima a-Gal A humana se administra a una dosis de 0, 01-100 mg / Kg. de peso corporal .