Proceso para la producción de anticuerpos de la glicoforma G1.

Método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con glicoestructura G1 que comprende las siguientes etapas:

- incubar un eluato de columna de cromatografía de afinidad que contiene la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una galactosiltransferasa,

- incubar el producto de reacción de galactosiltransferasa con una sialiltransferasa,

- incubar el producto de reacción de sialiltransferasa con una beta-1,4-galactosidasa,

- eliminar o inactivar la beta-1,4-galactosidasa, e

- incubar el producto de reacción de beta-1,4-galactosidasa, en el que la beta-1,4-galactosidasa se ha eliminado o inactivado, con una sialidasa y así producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con glicoestructura G1.

Proceso para la producción de anticuerpos de la glicoforma G1

La presente invención se refiere a un método para el procesamiento enzimático aguas abajo de inmunoglobulinas recombinantemente producidas. En más detalle, la presente invención se refiere a un método para producir una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura después de una etapa de cromatografía de afinidad por un tratamiento enzimático.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos obtenidos a partir de células eucariotas se producen como polipéptidos glicosilados. Las glicoestructuras están unidas al esqueleto del aminoácido como modificación enzimática postraduccional.

Las glicosiltransferasas son reconocidas como una familia funcional de aproximadamente 250-300 enzimas unidas a membrana intracelulares diferentes que participan en la biosíntesis coordinada de las glicoestructuras de polipéptidos, que incluyen glicoproteínas, proteoglicanos y glicolípidos. Las glicosiltransferasas se clasifican en grupos basándose en su especificidad por donante de monosacárido de nucleótido. Por ejemplo, las galactosiltransferasas son el subconjunto de glicosiltransferasas que usan UDP-galactosa como donante de monosacárido activado, mientras que las sialiltransferasas usan CMP-ácido siálico y las fucosiltransferasas usan GDP-fucosa (Formar, N.L., et al., J. Mamm. Gland Biol. Neopl. 3 (1998) 315-324).

Un método para el examen clínico basado en las estructuras de oligosacáridos ligados a inmunoglobulina G se informa en el documento EP 0 698 793. En el documento EP 1 878 747 se informan anticuerpos glicomanipulados. El marcado selectivo de glicanos de inmunoglobulina se informa en el documento WO 2007/071347. En el documento WO 1997/016064 se informan métodos y composiciones para la reducción del rechazo de xenotrasplante. Preparaciones de anticuerpos con glicoestructuras sustancialmente homogéneas y no sialiladas, tales como G0 y G2, que se preparan por tratamiento enzimático, expresión bajo ciertas condiciones, uso de células huésped particulares y contacto con suero, se informan en el documento WO 2007/024743.

En el documento WO 2008/057634 se informan polipéptidos con propiedades antiinflamatorias mejoradas y citotóxicas reducidas y métodos relacionados. Las preparaciones de anticuerpos resistentes a la proteólisis se informan en el documento WO 2007/024743.

Sumario de la invención

Se ha encontrado que con la secuencia de etapas enzimáticas que se informa en el presente documento puede obtenerse una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura, es decir, con una pureza del 90 % o más, con una pureza del 95 % o más, o con una pureza del 98 % o más.

Por tanto, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura a partir de una inmunoglobulina glicosilada o un fragmento de inmunoglobulina glicosilada o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada que es una mezcla de glicoestructuras G0, G1 y G2.

Por tanto, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura a partir de una inmunoglobulina glicosilada o un fragmento de inmunoglobulina glicosilada o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada que tiene una glicoestructura G0.

Por tanto, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura a partir de una inmunoglobulina glicosilada o un fragmento de inmunoglobulina glicosilada o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada que tiene una glicoestructura G2.

Así, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un fragmento de inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

proporcionar un eluato de columna de cromatografía de afinidad que contiene una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión, que es una mezcla de una glicoestructura G0, G1 y G2, incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina con una galactosiltransferasa,

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una sialiltransferasa, incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una beta-1,4- galactosidasa o lactasa,

eliminar o inactivar la beta-1,4-galactosidasa o lactasa, e

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una sialidasa y así producir una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 o un fragmento de inmunoglobulina con una glicoestructura G1 o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura.

Asi, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un fragmento de inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

proporcionar un eluato de columna de cromatografía de afinidad que contiene una inmunoglobulina, que tiene una glicoestructura G0, o un fragmento de inmunoglobulina, que tiene una glicoestructura G0, o un polipéptido de fusión, que tiene una glicoestructura G0,

incubar la inmunoglobulina o el fragmento de inmunoglobulina o el polipéptido de fusión con una galactosiltransferasa,

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o el polipéptido de fusión con una sialiltransferasa, incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o el polipéptido de fusión con una beta-1,4- galactosidasa o lactasa,

eliminar o inactivar la beta-1,4-galactosidasa o lactasa, e

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o el polipéptido de fusión con una sialidasa y así producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura.

Así, en el presente documento se informa un método para producir una inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un fragmento de inmunoglobulina con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura o un polipéptido de fusión que comprende un fragmento de inmunoglobulina glicosilada con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

proporcionar un eluato de columna de cromatografía de afinidad que contiene una inmunoglobulina, que tiene una glicoestructura G2, o un fragmento de inmunoglobulina, que tiene una glicoestructura G2, o un polipéptido de fusión, que tiene una glicoestructura G2,

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión con una sialiltransferasa, incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión con una beta-1,4- galactosidasa o lactasa,

eliminar o inactivar la beta-1,4-galactosidasa o lactasa, e

incubar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o un polipéptido de fusión con una sialidasa y así producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una glicoestructura G1 en forma sustancialmente pura.

En una realización, la galactosiltransferasa se añade en una a diez alícuotas. En una realización, la galactosiltransferasa se añade en dos a siete alícuotas. En una realización, la galactosiltransferasa se añade en tres a seis alícuotas. En una realización, la galactosiltransferasa se añade en cuatro o seis alícuotas.

En una realización, la incubación con la galactosiltransferasa es durante aproximadamente 30 horas a aproximadamente 60 horas.

En una realización, la primera... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con glicoestructura G1 que comprende las siguientes etapas:

- incubar un eluato de columna de cromatografía de afinidad que contiene la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con una galactosiltransferasa,

- incubar el producto de reacción de galactosiltransferasa con una sialiltransferasa,

- incubar el producto de reacción de sialiltransferasa con una beta-1,4-galactosidasa,

- eliminar o inactivar la beta-1,4-galactosidasa, e

- incubar el producto de reacción de beta-1,4-galactosidasa, en el que la beta-1,4-galactosidasa se ha eliminado o ¡nactlvado, con una sialidasa y así producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina o polipéptido de fusión con glicoestructura G1.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la galactosiltransferasa se añade durante la incubación en dos o más alícuotas.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la galactosiltransferasa se añade durante la incubación en tres a seis alícuotas.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera alícuota de la galactosiltransferasa se añade después de cero a dos horas de tiempo de incubación.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una alícuota de la galactosiltransferasa se añade cada una después de seis a doce horas de tiempo de incubación.