Un procedimiento de preparación industrial de fosfatidilserina.

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE FOSFATIDILSERINAS,

HACIENDO REACCIONAR UNA SERINA RACEMICA, O ENANTIOMERICAMENTE PURA, PREFERIBLEMENTE (L)-SERINA, CON FOSFATIDOS NATURALES, COMO SOJA O LECITINA DE HUEVO, O CON FOSFATIDOS SINTETICOS, EN PRESENCIA DE FOSFOLIPASA D, QUE TIENE ACTIVIDAD TRANSFOSFATIDILADORA, EN UN SISTEMA DIFASICO ACUOSO/ORGANICO.

Un procedimiento de preparación industrial defosfatidilserina

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de fosfatidilserinas de fórmula (I), denominadas en lo que sigue PS, mediante la reacción de serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente (L)-serina, con fosfatidas naturales, tales como lecitina de soja o huevo, o con fosfatidas sintéticas de fórmula (II), en presencia de una fosfollpasa D, denominada en lo que sigue PLD, con actividad transfosfatidilante, en un sistema bifásico acuoso/orgánico.

Los compuestos de la invención tienen las fórmulas generales (I) y (II):

CHjOR1

I

CHORJ

atjO-P(-0)-OCHrCH(NHi>COOH

X

(0

en las que

CtbOR1

I

CHOR1

I

avmoH»

(W)

Ft1 y Ft2, que son iguales o diferentes, están seleccionados de un acilo C10-C30 saturado, mono o poliinsaturado; X = OH u OM, en la que M es un metal alcalino, alcalinotérreo, amonio o alquilamonio;

F¡3 = CH2CH2NH2 o CH2CH2N+(CH3)3.

La Importancia de los compuestos (I) es diversa, particularmente en la preparación de composiciones farmacéuticas para la terapia de síndromes degenerativos cerebrales de diferente origen, tales como patologías vasculares de base aterosclerótica o no y/o decadencia senil; para la preparación de formulaciones liposomales, y más recientemente para composiciones dietéticas que comprenden lecitinas naturales, particularmente lecitina de soja enriquecida con fosfatidil-L-serina, representada en lo sucesivo como PS(L), que contiene ácidos grasos poliinsaturados como residuos acilo.

La creciente demanda de cantidades Industriales de PS(L) a un coste razonable impulsó al solicitante a llevar a cabo una completa investigación para satisfacer dicha necesidad.

Ya es conocida la preparación de fosfatidas (I) mediante PLD como catalizador enzimático de la reacción de transfosfatidllaclón. Sin embargo, los procedimientos conocidos se refieren a la preparación a escala de laboratorio (algunos gramos), y sufren una serle de desventajas, especificadas a continuación, que dificultan su traslado a escala industrial.

Se sabe también que no se consigue fácilmente la reproducibilidad industrial de procedimientos de laboratorio de reacciones enzlmátlcas, especialmente cuando se utilizan enzimas brutas.

Por otra parte, es Importante Indicar que las enzimas PLD son capaces de catalizar también la hidrólisis acuosa de fosfatidas, proporcionando ácido fosfatídico, representado en lo sucesivo como PA, en competición con la reacción de transfosfatldilación, estando la cinética de las dos reacciones altamente afectada por las condiciones de reacción y por el origen de la citada enzima.

Por ejemplo, Comfurius P. et al., en Blochlm. Blophys. Acta 488, 36 (1977) divulga en primer lugar la producción de una mezcla de aproximadamente 1/1 de PS(L) y PA, haciendo reaccionar a presión, a 45aC de temperatura y a pH 5,6, en un sistema bifásico éter etílico/agua, lecitina de huevo o fosfatidilcolinas sintéticas con L-serina en presencia de enzima PLD parcialmente purificada (de repollo).

Se purifica entonces la PS(L) mediante cromatografía sobre celulosa utilizando una mezcla de cloroformo/metanol como eluyente. Resulta evidente que dicho procedimiento no es adecuado para una producción Industrial, debido tanto al uso de éter etílico como a la baja selectividad.

Se han comunicado resultados más interesantes por Yamane T. et al., en Biochim. Biophys Acta 1003, 277 (1989), en

el que se compararon enzimas PLD de diferente origen (de repollo y de cepas de Streptomyces) con diferentes actividades transfosfatidilantes en la conversión de PC con (D)- y (L)-serina; se llevó a cabo también un estudio de diferentes parámetros de reacción tales como pH, disolvente, temperatura, reactivos y concentraciones de enzima (estudiado también después de inmovilización).

El pH considerado estaba en el intervalo entre 5,5 y 7,0, siendo el sistema bifásico de disolventes más eficaz para la enzima libre, éter-agua o acetato de etilo-agua, mientras que disolventes tales como benceno, tolueno o cloroformo son menos eficaces; por otro lado el acetato de etilo no es adecuado para la enzima inmovilizada. La temperatura está en el intervalo entre 20 y 402C y los ensayos se llevaron a cabo preferiblemente a 302C de temperatura, aunque la velocidad de reacción aumenta con la temperatura; los ensayos se llevaron a cabo a una concentración de serina 3,4 M que corresponde con su solubilidad a pH 5,6 a 302C de temperatura, mientras que se mantiene la concentración de PC muy baja (<53,4 mM, habitualmente 17,8 mM) y la concentración de enzima es 0,2-0,8 U/ml (se define una unidad como la cantidad de enzima que hidroliza en 1 minuto 1 pmol de PC pura a PA a 302±0,52C).

Utilizando una fosfatifilcolina altamente purificada, denominada en lo que sigue PC, se obtendría una conversión casi completa de la PS en las condiciones de reacción óptimas. Contrariamente a la PLD de repollo, las PLD bacterianas catalizan de forma similar latransfosfatidilación con (D) y (L)-serina.

Independientemente de las ventajas con respecto al procedimiento utilizado anteriormente, incluso este procedimiento no puede considerarse todavía industrialmente aplicable, puesto que el estudio se dirigía a encontrar las condiciones óptimas utilizando enzimas purificadas y PC altamente pura, mientras que no se decía nada acerca del uso de lecitinas de bajo coste y baja pureza y del uso de enzimas no purificadas.

El documento JP-A-63.036.791 divulga el uso de carbón activado o de otros vehículos en grandes cantidades como adsorbente para serina y PLD, suspendiendo el citado material en un disolvente de bajo contenido en agua (preferiblemente <0,2%) en el que se disuelve el fosfolípido, de modo que se reduzca la formación competitiva de PA. Como alternativa, se carga el citado disolvente en una columna y se eluye el disolvente orgánico a través de la columna. Este procedimiento es difícil de aplicar industrialmente puesto que la enzima y el sustrato deberían atraparse en el mismo vehículo y se requiere un contenido bajo en agua.

El documento JP-B-63.036.792 divulga el uso de PLD de repollo en un sistema bifásico de agua/éter diisopropílico como disolvente, operando en condiciones micelares. Se obtiene una conversión muy baja a partir de una lecitina de soja parcialmente purificada, con un contenido en PC de aproximadamente el 68%, siendo el contenido de PS(L) al final de la reacción del 24%.

Se comunicaron mejores resultados en el documento JP-B-02.079.996, en el que se utiliza una PLD de Streptomyces en acetato de etilo; sin embargo, incluso utilizando una fosfatidilcolina pura sintética como material de partida, el rendimiento de la PS(L) correspondiente es de aproximadamente el 68%, similar al comunicado en el documento JP-B- 63.123.389, en el que se convirtió PC de huevo en éter etílico en PS(D) mediante una PLD de Nocardiopsis o Actinomadura.

Finalmente, en Okahata Y. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,919 (1995) se divulga el uso de PLD de Streptomyces recubierta con lípidos, preparados separadamente, capaz de ejercer actividad catalítica en un disolvente orgánico a pH 5,5. Esta enzima debería ser mucho más activa que la enzima bruta con la que la reacción a menudo no se completa. A pesar de la indicación en el artículo de que la velocidad máxima de reacción de la enzima bruta se alcanza a valores de pH más ácidos de aproximadamente 4, la velocidad de reacción es sin embargo <2% de la de la enzima recubierta con lípido.

Utilizando un sistema bifásico agua/benceno como disolvente, PC de huevo a 402C de temperatura en 24 horas con la enzima recubierta con lípido, se obtendría una PS(L) con un rendimiento de aproximadamente el 75%.

A partir de las enseñanzas de la técnica anterior anteriormente discutida, los expertos en la técnica podrán concluir que:

el uso de lecitinas en bruto no es conveniente ni posible;

es necesario el uso de una enzima purificada o al menos no en estado bruto, y por lo tanto cara;

los disolventes industrialmente aceptables, no tóxicos y compatibles con el medio ambiente son difíciles de utilizar;

es necesario un exceso notable de serina, implicando por lo tanto la necesidad de recuperar o reciclar la serina. Por otra parte, los procedimientos cromatográficos descritos en los procedimientos anteriores son razones adicionales contra la aplicabilidad industrial de los citados procedimientos.

Sorprendentemente, la presente invención proporciona un procedimiento que permite superar las desventajas e inhibiciones de la técnica anterior, utilizando... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula (I)

en los que:

R¹ y R², que son iguales o diferentes, son acilos C₁₀-C₃₀ opcionalmente mono o poliinsaturados; X = OH u OM, en los que M es un metal alcalino o alcalinotérreo, amonio o alquilamonio (sal interna incluida); dicho procedimiento hacer reaccionar fosfátidos de fórmula general (II)

en la que R¹, R² y X tienen los significados anteriormente definidos y R³ = CH₂-CH₂NH₂ o CH₂-CH₂N⁺(CH₃)₃, con serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente con L-serina, en un sistema bifásico agua/ disolvente orgánico, en presencia de fosfolipasa D en bruto procedente de caldos de fermentación centrifugados de cepas de microorganismos productores de PLD extracelular con una elevada actividad de transfosfatidilación.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico es tolueno.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que los fosfátidos de fórmula general (II) son mezclas de fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina de origen natural, seleccionadas a partir de lecitinas de soja o huevo, con un contenido en fosfolípidos en un intervalo del 20% al 95%.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pH de reacción está en el intervalo de 4 a 4,5.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la temperatura de reacción es de 25ºC ± 5ºC.

6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fosfolipasa D en bruto se produce mediante la cepa de Streptomyces ATCC 55717.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, para la preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R₁ y R₂ son cadenas de acilo de ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico o linolénico en proporciones similares a las de la lecitina de soja.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1 para la preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R₁ y R₂ son cadenas de acilo de ácidos palmítico, esteárico, palmitoleico, oleico, linoleico o araquidónico en proporciones similares a las de la lecitina de huevo.

9. Un procedimiento para la purificación de fosfatidilserinas en forma de sales alcalinas, alcalinotérreas, de amonio o de alquilamonio, mediante la extracción selectiva de mezclas de fosfolípidos que contienen fosfatidilserina en sistemas bifásicos de disolventes orgánicos.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la fosfatidilserina se purifica a partir de otros fosfolípidos, particularmente fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilamina y los correspondientes lisofosfolípidos mediante extracción selectiva de la correspondiente sal de calcio a partir de una mezcla heptano/ metanol.

11. Un procedimiento para la posterior purificación de fosfatidilserina obtenida según la reivindicación 10, en el que la fosfatidilserina se somete a cristalización en heptano/ acetona, en la forma de sal de calcio, y su subsiguiente conversión en cualquier otra sal, de acuerdo con técnicas convencionales.

12. Un procedimiento para la recuperación de L-serina, como sólido cristalino, a partir de disoluciones acuosas de una reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la reivindicación 1; y en dicho procedimiento, tras la separación de la fase orgánica citada, la fase acuosa se concentra parcialmente a vacío para precipitar la L-serina cristalina.

13. Un procedimiento para la recuperación de L-serina, en forma de disolución acuosa exenta de sales inorgánicas y de sales de colina, a partir de disoluciones acuosas de una reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la reivindicación 1; y en dicho procedimiento, tras la filtración y separación de la fase orgánica, la citada fase acuosa se somete a electrodiálisis a un valor de pH de 5,7 ± 0,5 o, alternativamente, a tratamiento con resinas intercambiadoras de iones.

14. La cepa de Streptomyces depositada en la American Type Culture Collection con el número 55717 el 13/10/1995.