Polipéptidos de factor VII de coagulación humana.

Variante polipeptídica del factor VII de SEC ID nº 1 que se puede codificar por construcciones de polinucleótidos,

donde S314 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L, donde la proporción entre la actividad de dicha variante polipeptídica del factor VII y la actividad del polipéptido de factor VIIa nativo mostrada en la SEC ID nº 1 es al menos aprox. 2,0, cuando se evalúa en el Ensayo de hidrólisis in vitro.

Polipéptidos de factor VII de coagulación humana Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos de factor VII de coagulación humana nueva con actividad coagulante al igual que construcciones de polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores y células huésped que comprenden y expresan el polinucleótido, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.

Antecedentes de la invención [0002] La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes sanguíneos (o factores) que finalmente dan lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan en lo que se ha referido como la coagulación en "cascada", son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que por sí mismo es un factor de coagulación activado) . Los factores de coagulación que han sufrido tal conversión son generalmente referidos como "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (por ejemplo factor VIIa) .

La iniciación del proceso hemostático se media por la formación de un complejo entre factor tisular, expuesto como resultado de una lesión de la pared del vaso, y factor VIIa. Este complejo luego convierte los factores IX y X en sus formas activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina en trombina en la célula que produce el factor tisular. La trombina activa las plaquetas y los factores V y VIII en factores Va y VIIIa, ambos cofactores en otro proceso que lleva a la explosión de trombina completa. Este proceso incluye la generación del factor Xa por el factor IXa (en el complejo con factor VIIIa) y ocurre en la superficie de plaquetas activadas. La trombina convierte finalmente el fibrinógeno en fibrina dando como resultado la formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años se ha encontrado que el factor VII y el factor tisular son los iniciadores principales de la coagulación sanguínea.

El factor VII es una glicoproteína plasmática de trazo que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor VII monocatenario se puede convertir en factor VIIa bicatenario por factor Xa, factor XIIa, factor IXa, factor VIIa o trombina in vitro. Se cree que el factor Xa es el mayor activador fisiológico del factor VII. Como otras proteínas plasmáticas diferentes implicadas en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K para su actividad, que se requiere para la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico múltiples que son reagrupadas cerca del amino terminal de la proteína. Estos ácidos glutámicos gamma-carboxilados se requieren para la interacción inducida por iones de metal de factor VII con fosfolípidos. La conversión del factor VII zimógeno en la molécula bicatenaria activada ocurre por escisión de un enlace peptídico Arg152-Ile153 interno. En presencia de factor tisular, fosfolípidos e iones de calcio, el factor VIIa bicatenario activa rápidamente el factor X o factor IX por proteólisis limitada.

Es deseable frecuentemente estimular o mejorar la coagulación en cascada de un sujeto. El factor VIIa ha sido usado para controlar trastornos de sangrado que tienen diferentes causa tales como deficiencias de factor de coagulación (por ejemplo hemofilia A y B o deficiencia de factores XI o VII de coagulación ) o inhibidores de factor de coagulación. El factor VIIa también se ha usado para controlar el sangrado excesivo que ocurre en sujetos con un funcionamiento normal de la coagulación en cascada de la sangre (sin deficiencias de factor de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) . Este sangrado puede, por ejemplo, ser provocado por una función plaquetaria defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. El sangrado es también un problema importante en relación con la cirugía y otras formas de daño de tejido.

La patente europea nº 200, 421 (ZymoGenetics) se refiere al factor VII humano de codificación de secuencia de nucleótidos y la expresión recombinante del factor VII en células de mamíferos.

Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU (1996) 93, 14379-14384) se refiere a una variante del Factor VII donde Leu305 se ha sustituido por Ala (FVII (Ala305) ) .

Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999) , 466, abstract 1474) se refiere a variantes del factor VIIa donde los residuos 316-320 son eliminados o los residuos 311-322 se sustituyen con los residuos correspondientes de tripsina.

El documento WO0158935 se refiere a conjugados que comprenden al menos una molécula no polipeptídica de manera covalente fijado a un FVII polipéptido.

El documento US 5580560 se refiere a moléculas de factor VII/VIIa modificadas que se estabilizan contra la escisión proteolítica, sobre todo mediante la modificación de la molécula en uno o varios sitios de escisión de tipo tripsina.

Hay una necesidad de variantes del factor VIIa con actividad coagulante, variantes con actividad alta que se pueden administrar en dosis relativamente bajas y variantes que no producen los efectos secundarios indeseables tales como activación sistémica del sistema de coagulación y sangrado, respectivamente, asociados a terapias convencionales.

Descripción de la invención [0012] Se acaba de descubrir que las variantes polipeptídicas del factor de coagulación VIIa humano con mutaciones en el bucle que comprende residuos de aminoácidos 313-329 de SEC ID nº 1 (por ejemplo Ser314 y Lys316) y en posiciones fuera de este rango, pero espacialmente próximas a este bucle (por ejemplo Trp364; Gln366; His373 y Val376) han aumentado la actividad en comparación con el factor VIIa de tipo salvaje.

La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas del factor VII de SEC ID nº : 1 que se pueden codificar por construcciones de polinucleótidos, donde S314 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L, donde la proporción entre la actividad de la variante polipeptídica del factor VII y la actividad del polipéptido de factor VIIa nativo de SEC ID nº 1 es al menos aprox. 2, 0 cuando se ha evaluado en el Ensayo de hidrólisis in vitro. Dicho S314 se puede sustituir con un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Gly y Glu.

Las variantes polipeptídicas del factor VII de SEC ID nº 1 pueden además comprender al menos una sustitución de aminoácido de uno o más aminoácido/s seleccionados del grupo consistente en aminoácidos 313-329 de SEC ID nº

1. En una forma de realización, K316 se puede sustituir con cualquier otro aminoácido natural de forma L, como un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Gly, His, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp y Glu.

La variante polipeptídica del factor VII puede comprender además la sustitución de al menos un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de proteasa con cualquier otro aminoácido natural de forma L. En una forma de realización, a lo sumo 20 aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio de proteasa se pueden sustituir con otro aminoácido natural de forma L. En otra forma de realización, al menos un aminoácido que corresponde con un aminoácido en una posición seleccionada de 330-339 de SEC ID nº 1 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L. En otra forma de realización, uno o varios aminoácidos seleccionados del grupo consistente en aminoácidos L305, K157, K337, D334, S336, V158, E296 y M298 de SEC ID nº 1 se sustituyen con cualquier otro aminoácido/s natural/es de forma de L.

El término "actividad" como se utiliza en este caso significa la capacidad de un polipéptido del factor VII para convertir el sustrato de factor X en el factor Xa activo. La actividad de un polipéptido del factor VII se puede medir con el "Ensayo de proteólisis in vitro" (véase ejemplo 5) .

El término "actividad inherente" también incluye la capacidad para generar trombina en la superficie de plaquetas activadas en ausencia de factor tisular.

Debido a la actividad inherente más alta de las variantes polipeptídicas del factor VIIa descritas en comparación con FVIIa nativo, se puede adecuar una dosis inferior para obtener una concentración funcionalmente adecuada en el sitio de acción y así será posible administrar una dosis inferior al sujeto con episodios de sangrado o necesidad de mejora del sistema hemostático normal.

Se ha descubierto por los presentes inventores que al sustituir los aminoácidos en el bucle que comprenden residuos de aminoácidos 313-329 de SEC ID nº 1,... [Seguir leyendo]

1. Variante polipeptídica del factor VII de SEC ID nº 1 que se puede codificar por construcciones de polinucleótidos, donde S314 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L, donde la proporción entre la actividad de dicha variante polipeptídica del factor VII y la actividad del polipéptido de factor VIIa nativo mostrada en la SEC ID nº 1 es al menos aprox. 2, 0, cuando se evalúa en el Ensayo de hidrólisis in vitro.

2. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 1, donde dicho S314 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Gly y Glu.

3. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 2, donde S314 se sustituye con Glu.

4. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 3, que es S314E-FVIIa.

5. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 1, que comprende además al menos una sustitución de aminoácido de uno o varios aminoácido/s seleccionado/s del grupo consistente en los aminoácido.

31. 329 de SEC ID nº 1.

6. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 5, donde K316 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L.

7. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 6, donde K316 se sustituye con un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Gly, His, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp y Glu.

8. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 7, donde dicho K316 se sustituye con Gln.

9. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 8, que es S314E/K316Q-FVII.

10. Variante polipeptídica del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde al menos un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de proteasa se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L.

11. Variante polipeptídica del factor VII según la reivindicación 10, donde a lo sumo 20 aminoácidos adicionales en las posiciones restantes en el dominio de proteasa se sustituyen con otros aminoácidos naturales de forma L.

12. Variante polipeptídica del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde al menos un aminoácido que corresponde con un aminoácido en una posición seleccionada d.

33. 339 de SEC ID nº 1 se sustituye con cualquier otro aminoácido natural de forma L.

13. Variante polipeptídica del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde uno o varios aminoácidos seleccionados del grupo consistente en los aminoácidos L305; K157; K337; D334; S336; V158; E296 y M298 de SEC ID nº 1 se sustituyen con cualquier otro aminoácido natural de forma L.

14. Variante polipeptídica del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde la proporción entre la actividad de dicha variante polipeptídica del factor VII y la actividad del polipéptido de factor VIIa nativo mostrados en la SEC ID nº 1 es al menos aprox. 4, 0, cuando se evalúa en el Ensayo de hidrólisis in vitro.

15. Construcción polinucleótida que codifica una variante polipeptídica del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Construcción polinucleótida según la reivindicación 15, que es un vector.

17. Célula huésped que comprende la construcción polinucleótida según cualquiera de las reivindicaciones 15-16.

18. Célula huésped según la reivindicación 17, que es una célula eucariota.

19. Célula huésped según la reivindicación 18, que es de origen mamífero.

20. Célula huésped según la reivindicación 19, donde la célula se selecciona del grupo consistente en células CHO, células HEK y células BHK.

21. Método para producir la variante polipeptídica del factor VII definida en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, el

método comprendiendo el cultivo de una célula tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17-20 en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la expresión de la construcción polinucleótida y la recuperación del polipéptido resultante del medio de cultivo.

22. Composición farmacéutica que comprende una variante polipeptídica del factor VII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

23. Uso de una variante polipeptídica del factor VII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos de sangrado o episodios de sangrado o para la mejora 10 del sistema hemostático normal.

24. Uso según la reivindicación 23 para el tratamiento de la hemofilia A o B.

25. Variante polipeptídica del factor VII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para uso como un 15 medicamento.