Métodos de inducción de la diferenciación terminal.

Una forma cristalina de ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) que se puede obtener mediante un método de recristalización que comprende las etapas de:

A. preparar un preparado en bruto de SAHA, comprendiendo dicha preparación las etapas de:

(i) sintetizar ácido suberanílico usando la reacción: **Fórmula**

reacción que consiste en las etapas de:

a) colocar, en un matraz de 22 l, 3,5 kg (20,09 mol) de ácido subérico y fundir el ácido con calor;

b) elevar la temperatura hasta 175 ºC, y luego añadir 2,04 kg (21,92 mol) de anilina;

c) elevar la temperatura hasta 190 ºC y mantener esa temperatura durante 20 minutos;

d) verter la masa fundida en un tanque de Nalgene que contiene 4,017 kg de hidróxido de potasio disueltos en 50 l de agua; e) agitar la mezcla durante 20 minutos tras la adición de la masa fundida;

f) repetir las etapas de reacción a)-c) a la misma escala, y verter la segunda masa fundida resultante en la solución de hidróxido de potasio de la etapa d);

g) agitar bien la mezcla de reacción, tras lo que se apaga el agitador y se deja sedimentar la mezcla;

h) filtrar la mezcla a través de un lecho corto de Celite de 4,2 kg para retirar el subproducto neutro del ataque por la anilina en ambos extremos del ácido subérico, dejando la mezcla sedimentar durante el proceso de filtración, proceso que dura varios días;

i) acidificar el filtrado usando 5 l de ácido clorhídrico concentrado;

j) agitar la mezcla durante una hora y luego dejar que la mezcla se sedimente durante la noche;

k) recoger el producto por filtración;

l) lavar el producto en un embudo con cuatro porciones de 5 l de agua desionizada;

m) colocar la torta del filtro húmeda en un matraz de 72 l con 44 l de agua desionizada;

n) calentar la mezcla hasta 50 ºC;

o) aislar el sólido mediante una filtración en caliente;

p) retirar el ácido subérico usando varias trituraciones en caliente, en las que el producto se verifica por RMN [D6DMSO] para controlar la eliminación del ácido subérico;

q) repetir las etapas o) y p) con 44 l de agua a 50 ºC al menos una vez;

r) aislar el producto por filtración;

s) enjuagar el producto aislado con 4 l de agua caliente;

t) secar el producto durante dos días en un horno de vacío a 65 ºC usando una bomba Nash como fuente de vacío, siendo la bomba Nash una bomba de anillo de agua que extrae un vacío de 98,2 kPa (982 mbar) y en la que se usa una purga de argón intermitente para ayudar a arrastrar el agua;

u) purificar el producto mediante trituración en caliente en porciones a 65 ºC usando aproximadamente 300 g de producto cada vez;

v) filtrar cada porción y enjuagar bien con un total de 6 l de agua caliente;

w) repetir las etapas u) y v) hasta que el ácido subérico se haya eliminado por completo del producto;

x) combinar el producto sólido en un matraz y agitar con 6 l de una mezcla 1:2 de metanol/agua;

y) aislar el producto por filtración y secar al aire el producto sobre el filtro durante dos días;

z) colocar el producto en bandejas y secar el producto al vacío a 65 ºC durante 45 horas usando una bomba Nash y un flujo de argón;

(ii) sintetizar suberanilato de metilo usando la reacción: **Fórmula**

Métodos de inducción de la diferenciación terminal Campo de la invención

La presente invención proporciona una forma cristalina de ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) para inducir selectivamente la diferenciación terminal, la detención del crecimiento celular y/o la apoptosis de las células neoplásicas, y/o inhibir las histona desacetilasas (HDAC), y de composiciones farmacéuticas que comprenden SAHA. Las formulaciones orales de las composiciones farmacéuticas tienen perfiles farmacocinéticos favorables, tales como una alta biodisponibilidad y, sorprendentemente, dan lugar a niveles elevados en sangre de los compuestos activos durante un período prolongado de tiempo.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones mediante números arábigos entre paréntesis. Las citas completas de estas publicaciones se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

El cáncer es un trastorno en el que una población de células ha dejado de responder, en diversos grados, a los mecanismos de control que normalmente gobiernan la proliferación y la diferenciación. Durante muchos años, ha habido dos estrategias principales para el tratamiento quimioterapéutico del cáncer: a) el bloqueo de la proliferación de las células tumorales dependiente de hormonas interfiriendo en la producción o la acción periférica de las hormonas sexuales; y b) la destrucción de las células cancerosas directamente, exponiéndolas a sustancias citotóxicas que lesionan las poblaciones tanto de células neoplásicas como de células normales

También se está intentando tratar el cáncer mediante la inducción de la diferenciación terminal de las células neoplásicas (1). En modelos de cultivo celular, se ha informado de la diferenciación mediante la exposición de las células a varios estímulos, incluyendo: AMP cíclico y ácido retinoico (2, 3), aclarubicina y otras antraciclinas (4).

A pesar de los numerosos avances en el campo de la oncología, la mayoría de los tumores sólidos sigue siendo incurable en los estadios avanzados. En la mayoría de los casos, se usa la terapia citotóxica; sin embargo, con frecuencia provoca una importante morbilidad en el paciente sin ningún beneficio clínico significativo. Se están investigando agentes menos tóxicos y más específicos para tratar y controlar los tumores malignos avanzados.

Existen abundantes pruebas de que la transformación neoplásica no destruye necesariamente el potencial de las células cancerosas para diferenciarse (1, 5, 6). Hay muchos ejemplos de células tumorales que no responden a los reguladores normales de la proliferación y parecen encontrarse bloqueados en la expresión de su programa de diferenciación, pudiéndose hacer, sin embargo, que se diferencien y cesen su replicación. Varios agentes, incluyendo algunos compuestos polares relativamente simples (5, 7-9), derivados de la vitamina D y el ácido retinoico (10-12), hormonas esferoides (13), factores de crecimiento (6, 14), proteasas (15, 16), promotores tumorales (17, 18) e inhibidores de la síntesis del ADN o del ARN (4, 19-24) pueden hacer que diversas líneas celulares transformadas y explantes tumorales humanos primarios expresen características más diferenciadas.

Los primeros estudios identificaron una serie de compuestos polares que resultaron ser inductores eficaces de la diferenciación en una serie de líneas celulares transformadas (8, 9). Entre ellos, el inductor más eficaz resultó ser el compuesto híbrido polar/apolar /V,/V'-hexametilén bisacetamida (HMBA) (9). El uso de este compuesto polar/apolar para hacer que células de eritroleucemia murina (MELC) se sometan a una diferenciación eritroide con supresión de la oncogenicidad ha demostrado ser un modelo útil para el estudio de la diferenciación mediada por inductores de células transformadas (5, 7-9). La diferenciación eritroide terminal de MELC inducida por HMBA es un proceso de múltiples etapas. Tras la adición de HMBA a MELC (745A-DS19) en cultivo, tiene lugar un período latente de 10 a 12 horas antes de poderse detectar la dedicación hacia la diferenciación terminal. Dedicación se define como la capacidad de las células para expresar la diferenciación terminal a pesar de la retirada del inductor (25). Tras la exposición continua a HMBA, se produce un reclutamiento progresivo de las células hacia la diferenciación. Los presentes inventores han informado de que las líneas celulares MELC convertidas en resistentes a niveles relativamente reducidos de vincristina se sensibilizan notablemente hacia la acción inductora de la HMBA, pudiéndose inducir la diferenciación con un período latente breve o nulo (26).

La HMBA es capaz de inducir cambios fenotípicos de acuerdo con la diferenciación en una amplia variedad de líneas celulares (5). Las características del efecto inducido farmacológicamente se han estudiado más ampliamente en el sistema celular de la eritroleucemia murina (MELC) (5, 25, 27, 28). La inducción de MELC a diferenciarse depende tanto del tiempo como de la concentración. La concentración mínima necesaria para demostrarse un efecto in vitro en la mayoría de cepas es de 2 a 3 mM; la duración mínima de la exposición continua que se necesita en general para inducir la diferenciación en una parte sustancial (>20 %) de la población sin exposición continua a un fármaco es de aproximadamente 36 horas.

Se desconoce la diana de acción principal de la HMBA. Hay pruebas de que la proteína quinasa C participa en la

ruta de la diferenciación mediada por inductor (29). Los estudios in vitro proporcionan una base para evaluar el potencial de la HMBA como agente de citodife rene i ación en el tratamiento de los cánceres humanos (30). Se han completado varios ensayos clínicos de fase I con HMBA (31-36). Los ensayos clínicos han demostrado que este compuesto puede inducir una respuesta terapéutica en pacientes con cáncer (35, 36). Sin embargo, estos ensayos clínicos de fase I también han demostrado que la posible eficacia de la HMBA es limitada, en parte, por la toxicidad relacionada con la dosis, que impide que se alcancen niveles óptimos en sangre, y por la necesidad de administrar por vía intravenosa grandes cantidades del agente durante períodos prolongados.

Se ha informado de que una serie de compuestos relacionados con la HMBA con grupos polares separados por enlaces apolares, en una base molar, son tan activos (37) o 100 veces más activos que la HMBA (38). Sin embargo, como clase, se ha encontrado que los dímeros simétricos, tales como la HMBA y compuestos relacionados, no son los mejores agentes de citodiferenciación.

Inesperadamente, se ha encontrado que los mejores compuestos comprenden dos grupos de extremo polar separados por una cadena flexible de grupos metileno, en los que uno o ambos grupos de extremo polar son grupos hidrófobos grandes. Preferentemente, los grupos de extremo polar son diferentes, y solo uno es un grupo hidrófobo grande. Inesperadamente, estos compuestos son mil veces más activos que la HMBA y diez veces más activos que los compuestos relacionados con la HMBA.

Los inhibidores de las histona desacetilasas, tales como el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), pertenecen a esta clase de agentes que tienen la capacidad de inducir la detención del crecimiento, la diferenciación y/o la apoptosis de las células tumorales (39). Stowell et al. describen, en J. Med. Chem. (1995) vol. 38(8), páginas 1411- 13, un proceso de preparación de ácido hidroxámico suberoilanilida cristalino a partir de ácido subérico. Estos compuestos se dirigen a mecanismos inherentes a la capacidad de una célula neoplásica de convertirse en maligna, dado que parecen no tener toxicidad a dosis eficaces para la inhibición del crecimiento tumoral en animales (40). Hay varias líneas que evidencian que la acetilación y la desacetilación de las histonas son mecanismos mediante los que se consigue la regulación de la transcripción en una célula (41). Se cree que estos efectos se producen a través de cambios en la estructura de la cromatina, mediante la alteración de la afinidad de las proteínas histonas por el ADN enrollado en el nucleosoma. Se han identificado cinco tipos de histonas en los nucleosomas (denominadas H1, H2A, H2B, H3 y H4). Cada nucleosoma contiene dos histonas de cada tipo dentro de su núcleo, a excepción de H1, que está presente individualmente en la parte exterior de la estructura del nucleosoma. Se cree que, cuando las proteínas histonas se encuentran hipoacetiladas, hay una mayor afinidad de la histona hacia la estructura principal de fosfatos del ADN. Esta afinidad hace que el ADN se una firmemente a la histona... [Seguir leyendo]

1. Una forma cristalina de ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) que se puede obtener mediante un método de recristalización que comprende las etapas de:

A. preparar un preparado en bruto de SAHA, comprendiendo dicha preparación las etapas de:

(i) sintetizar ácido suberanílico usando la reacción:

reacción que consiste en las etapas de:

a) colocar, en un matraz de 22 I, 3,5 kg (20,09 mol) de ácido subérico y fundir el ácido con calor;

b) elevar la temperatura hasta 175 2C, y luego añadir 2,04 kg (21,92 mol) de anilina;

c) elevar la temperatura hasta 190 2C y mantener esa temperatura durante 20 minutos;

d) verter la masa fundida en un tanque de Nalgene que contiene 4,017 kg de hidróxido de potasio disueltos en 50 I de agua;

e) agitar la mezcla durante 20 minutos tras la adición de la masa fundida;

f) repetir las etapas de reacción a)-c) a la misma escala, y verter la segunda masa fundida resultante en la solución de hidróxido de potasio de la etapa d);

g) agitar bien la mezcla de reacción, tras lo que se apaga el agitador y se deja sedimentar la mezcla;

h) filtrar la mezcla a través de un lecho corto de Celite de 4,2 kg para retirar el subproducto neutro del ataque por la anilina en ambos extremos del ácido subérico, dejando la mezcla sedimentar durante el proceso de filtración, proceso que dura varios días;

i) acidificar el filtrado usando 5 I de ácido clorhídrico concentrado;

j) agitar la mezcla durante una hora y luego dejar que la mezcla se sedimente durante la noche;

k) recoger el producto por filtración;

l) lavar el producto en un embudo con cuatro porciones de 5 I de agua desionizada;

m) colocar la torta del filtro húmeda en un matraz de 72 I con 44 I de agua desionizada;

n) calentar la mezcla hasta 50 2C;

o) aislar el sólido mediante una filtración en caliente;

p) retirar el ácido subérico usando varias trituraciones en caliente, en las que el producto se verifica por RMN [D6DMSO] para controlar la eliminación del ácido subérico;

q) repetir las etapas o) y p) con 44 I de agua a 50 2C al menos una vez;

r) aislar el producto por filtración;

s) enjuagar el producto aislado con 4 I de agua caliente;

t) secar el producto durante dos días en un horno de vacío a 65 2C usando una bomba Nash como fuente de vacío, siendo la bomba Nash una bomba de anillo de agua que extrae un vacío de 98,2 kPa (982 mbar) y en la que se usa una purga de argón intermitente para ayudar a arrastrar el agua;

u) purificar el producto mediante trituración en caliente en porciones a 65 2C usando aproximadamente 300 g de producto cada vez;

v) filtrar cada porción y enjuagar bien con un total de 6 I de agua caliente;

w) repetir las etapas u) y v) hasta que el ácido subérico se haya eliminado por completo del producto;

x) combinar el producto sólido en un matraz y agitar con 6 I de una mezcla 1:2 de metanol/agua;

y) aislar el producto por filtración y secar al aire el producto sobre el filtro durante dos días;

z) colocar el producto en bandejas y secar el producto al vacío a 65 2C durante 45 horas usando una bomba Nash y un flujo de argón;

(ii) sintetizar suberanilato de metilo usando la reacción:

(CHafc.OH

(CH;,)k sOCIH$

reacción que consiste en las etapas de:

a) colocar en un matraz de 50 I dotado de un agitador mecánico y condensador 3,229 kg de ácido suberanílico producido mediante síntesis (i), 20 I de metanol y 398,7 g de resina Dowex 50WX2-400;

b) calentar la mezcla a reflujo y mantenerla a reflujo durante 18 horas;

c) filtrar la mezcla para retirar las perlas de resina;

d) extraer el filtrado hasta el residuo en un evaporador rotatorio;

e) transferir el residuo del evaporador rotatorio a un matraz de 50 I dotado de un condensador y un agitador mecánico, y añadir 6 I de metanol al matraz;

f) calentar la mezcla, dando una solución;

g) añadir 2 I de agua desionizada al matraz y apagar el calor;

h) dejar que se enfrié la mezcla agitada, y luego colocar el matraz en un baño de hielo;

i) enfriar la mezcla;

j) aislar el producto sólido por filtración y enjuagar la torta del filtro con 4 I de una mezcla fría de metanol/agua 1:1;

k) secar el producto a 45 2C en un horno de vacío usando una bomba Nash durante un total de 64 horas;

(iii) sintetizar SAHA en bruto usando la reacción:

reacción que consiste en las etapas de:

a) añadir a un primer matraz de 50 I con un agitador mecánico, termopar y entrada para atmósfera inerte

I, 4519 kg de clorhidrato de hidroxilamina, 19 I de metanol anhidro y 3,93 I de solución de metóxido de sodio al 30 % en metanol;

b) cargar el matraz con 2,748 kg de suberanilato de metilo, seguidos de 1,9 I de solución de metóxido de sodio al 30 % en metanol;

c) dejar agitando la mezcla durante 16 h y 10 minutos;

d) transferir aproximadamente la mitad de la mezcla de reacción desde el primer matraz a un segundo matraz de 50 I dotado de un agitador mecánico;

e) añadir 27 I de agua desionizada al primer matraz y agitar la mezcla durante 10 minutos, siendo el pH

II, 56 medido usando un medidor de pH;

f) ajustar el pH de la mezcla hasta 12,02 mediante la adición de 100 mi de solución de metóxido de sodio al 30 % en metanol, dando una solución transparente;

g) diluir la mezcla de reacción en el matraz 2 de la misma manera que en la etapa e);

h) ajustar el pH de la mezcla hasta 12,01 mediante la adición de 100 mi de solución de metóxido de sodio al 30 % en metanol, dando una solución transparente;

i) acidificar la mezcla de reacción de cada matraz mediante la adición de ácido acético glacial para hacer precipitar el producto, teniendo el primer matraz un pH final de 8,98 y el segundo matraz, un pH final de 8,70;

i) aislar el producto de ambos matraces por filtración usando un embudo Buchnery un filtro de tela;

k) lavar la torta del filtro con 15 I de agua desionizada, tapando el embudo y secando parcialmente el producto sobre el embudo al vacío durante 15,5 horas;

l) retirar el producto y colocarlo en cinco bandejas de vidrio;

m) colocar las bandejas en un horno de vacío y secar el producto hasta un peso constante, siendo el primer período de secado de 22 horas a 60 2C usando una bomba Nash como fuente de vacío con un flujo de argón, tras lo cual las bandejas se retiran del horno de vacío y se pesan, para devolverlas luego al horno y secar el producto durante 4 horas y 10 minutos más usando una bomba de aceite como fuente de vacío sin flujo de argón;

n) envasar el material en bolsas dobles de polietileno de 4 mm y colocarlas en un recipiente exterior de plástico;

B. preparar SAHA cristalino a partir del preparado en bruto de SAHA mediante:

a) la carga de un matraz de 50 I dotado de un agitador mecánico, termopar, condensador y entrada para atmósfera inerte con 2,5257 kg de SAHA en bruto preparado en el apartado A, seguidos de 2,625 I de agua desionizada y 15,755 I de metanol;

b) calentamiento del material a reflujo, dando una solución;

c) adición de 5,250 I de agua desionizada a la mezcla de reacción;

d) apagado del calor y dejar que la mezcla se enfríe hasta 28 2C;

e) retirada del matraz de la manta calefactora y colocación del mismo en una bañera para usarla como baño de enfriamiento;

f) adición de agua con hielo a la bañera hasta enfriar la mezcla hasta -5 2C;

g) mantenimiento de la mezcla por debajo de -5 2C durante dos horas;

h) aislamiento del producto por filtración y lavado de la torta del filtro con 1,5 I de una mezcla fría de metanol/agua 2:1;

i) tapado del embudo y secado parcial del producto al vacío durante 1,75 horas;

j) retirada del producto del embudo y colocación del mismo en 6 bandejas de vidrio;

k) colocación de las bandejas en un horno de vacío y secado del producto durante 64,75 horas a 60 2C usando una bomba Nash como fuente de vacío y usando un flujo de argón;

l) retirada de las bandejas para pesarlas y posterior devolución de las bandejas al horno y secado durante 4 horas más a 60 2C usando una bomba de aceite sin flujo de argón, dando un peso constante;

m) envasado del material en bolsas dobles de polietileno de 4 mm y colocación de las mismas en un

recipiente exterior de plástico.

2. Un principio activo que consiste en la forma cristalina de ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica para la administración oral que comprende el principio activo de la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, formulado en forma sólida.

4. Una composición farmacéutica para la administración oral que comprende la forma cristalina de ácido hidroxámico 25 suberoilanilida (SAHA) de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, formulado en

forma sólida.