Método para la detección de los virus de la gripe A/B en saliva.

Método para la detección de una infección con el virus de la gripe A y/o B que incluye los pasos i) Obtención de una muestra de saliva;

ii) Preparación de la muestra de saliva para la detección; y iii) Detección del virus de la gripe A y/o B en la muestra de saliva que se caracteriza por que la muestra de saliva que se obtiene en el paso i) es saliva formada espontáneamente, de manera que en la toma de la muestra de saliva no se realiza ningún enriquecimiento de virus en la muestra, sino que solamente se recoge la saliva que se encuentra en la boca de forma espontánea.

Método para la detección de los virus de la gripe A/B en saliva

La Invención se refiere a un método para detectar los virus de la gripe A/B asi como a la utilización de saliva como material de prueba para la detección de los virus gripales A/B.

La gripe es una enfermedad Infecciosa subestimada frecuentemente, que en particular en las personas mayores y en los pacientes de riesgo puede conducir a una tasa de morbididad y de mortalidad. Los virus de la gripe A y/o B (llamados de forma abreviada; virus de la gripe A/B) son responsables de la auténtica gripe vírica, que padecen anualmente en el mundo entero varios cientos de millones de personas. Los virus de la gripe A y B afectan básicamente a la zona de la nariz, boca y la faringe o garganta y causan inicialmente síntomas en general respiratorios.

Incluso al médico experimentado no le es posible diagnosticar la gripe con gran seguridad con ayuda exclusivamente de la sintomática clínica del paciente, puesto que otros virus que atacan la zona de la nariz o de la garganta como el adenovirus, el virus parainfluenza o paragripal, o el virus respiratorio sincitial (RS), tienen una sintomática comparable.

Debido a la gran Importancia medicinal de la infección de la gripe casi cada país de la tierra dispone de un sistema de vigilancia o control de la gripe organizado desde un punto de vista nacional. Para ello los médicos de los consultorios obtienen un frotis nasal y/o de la faringe del paciente sospechoso y éste se envía al centro de referencia nacional correspondiente. La detección del virus de la gripe A/B se realiza habitualmente por elución de la solución tampón del frotis y posterior cultivo de la muestra del paciente de células mamíferas, por ejemplo, células MDCK (células Madln-Darby Canine Kidney).

El cultivo en este laboratorio especial puede requerir hasta 14 días y por lo tanto no es de una relevancia inmediata como diagnóstico para cada uno de los pacientes. El cometido de los centros de referencia nacional consiste en tipificar y subtipificar los virus cultivados y comunicar los resultados a la organización mundial de la salud (OMS). El cometido del fabricante de las vacunas consiste pues en adaptar las vacunas de la gripe de años posteriores a las cepas víricas que circulan últimamente según la recomendación anual de la OMS.

El motivo de la mayor variabilidad genética y por tanto inmunológica, en particular en el virus A de la gripe, se debe a que además del viraje genético habitual (mutación puntual) en algunos casos puede producirse también un cambio genético ("reassortment", es decir, una nueva clasificación del gen vírico). Esto viene condicionado por el hecho de que el genoma del virus de la gripe se presenta segmentado contrariamente a otros virus y por qué la gripe A es tanto patógena en el hombre como en el animal.

Los antígenos inmunodominantes que se asientan en la superficie del virus son la hemoglutinina (H) y la neuraminidasa (N). En la gripe A se conocen actualmente 15 subtipos de hemoglutinina (H1-H15) y 9 subtipos de neuraminidasa (N1-N9).

Por ejemplo, en la confección de una célula huésped (por ejemplo, de un cerdo) con un virus de la gripe del tipo A patógeno en el ser humano y con un virus de pájaro de la gripe del tipo A se puede producir una nueva clasificación ("reassortment") del genoma vírico y por tanto un nuevo subtipo de virus A de la gripe, que luego en la transmisión al ser humano se introduce totalmente en su sistema inmunológico. Un ejemplo reciente de ello fue la aparición del llamado virus de la gripe aviar o gripe del pollo en mayo de 1997 en Hong Kong (tipo A/H5N1/Hong Kong/156/97), que a pesar de una detección precoz y un tratamiento médico intensivo provocó la muerte de 6 de los 18 pacientes afectados.

Para que se produzca una gran epidemia o ciertamente una pandemia mundial se debe transmitir un subtipo nuevo de virus de la gripe directamente de hombre a hombre, como lo que ocurrió en 1918/19 en la primera aparición del subtipo H1N1 (gripe española, aproximadamente 5 millones de muertos en el mundo entero), en 1957 (H2N2, gripe asiática, aproximadamente 1 millón de víctimas) y 1968 (H3N2, gripe de Hong Kong, aproximadamente 1 millón de víctimas).

Desde hace poco se dispone de una nueva generación de fármacos para la gripe, los llamados inhibidores de la neuraminidasa, que posibilitan inicialmente una terapia causal de la gripe y por lo tanto se consideran entre los círculos de expertos como la verdadera irrupción en la terapia de la gripe. Los estudios clínicos sobre la admisión de esta nueva clase de sustancias han demostrado que el éxito de la terapia depende notablemente de un inicio prematuro del tratamiento tras la aparición de los primeros síntomas clínicos. Debido a esta nueva opción terapéutica, la necesidad de un inicio prematuro de la terapia por un lado y de una sintomática clínica relativamente poco específica por otro lado parece un diagnóstico individual rápido como terapia decisiva.

Por ello recientemente algunos fabricantes de diagnósticos han desarrollado pruebas rápidas inmunológicas para la gripe a base de una detección de antígenos, de manera que estas pruebas rápidas sobre frotis de la nariz y/o de la

faringe o bien sobre el líquido obtenido por los enjuagues nasales se recogen como material de prueba. Los ejemplos de dichas pruebas rápidas para la gripe son el test rápido para la gripe A/B de la empresa Roche Dlagnostlcs GMBH, el Quick Vue de Quidel y el AB FLU OIA de Blostar.

Un problema especial en la obtención de muestras consiste en que de la zona o región infectada de la nariz o de la faringe se tiene que extraer el material de prueba, que contenga una cantidad suficiente para una detección de virus de gripe A y/o de gripe B (a continuación en forma abreviada: virus de la gripe A/B). La calidad de la toma de muestra tiene por tanto un efecto directo en la tasa de positividad del test rápido, cuya sensibilidad clínica es habitualmente de alrededor del 7%, es decir en el 7% de todas las muestras evaluadas como positivas en gripe mediante el método de referencia (cultivo celular), el test o la prueba rápida inmunológica es también positiva. Los fabricantes de diagnósticos indican por tanto en las fichas de embalaje sus pruebas rápidas de gripe, de manera que la extracción de muestras únicamente pueda ser realizada por personal médico especialmente instruido para garantizar que el material de prueba obtenido contiene realmente cantidades suficientes de virus de gripe A/B.

Además resulta difícil el que en la zona de la faringe las regiones rascadas (pared posterior de la faringe, faringe, amígdalas) se puedan distinguir en función de la infección vírica existente. Esto significa por ejemplo que para la detección de una infección por estreptococo deben rascarse otras zonas de la faringe que las que corresponden a una detección del virus de la gripe A/B.

La toma de un frotis nasal o de la faringe es algo incómodo para el paciente y en particular resulta un problema en el caso de los niños (pequeños). Por otro lado los niños, al menos en la fase precoz de una epidemia de gripe, son los principales portadores de la gripe vírica debido a su contacto social (guarderías, colegio) y al sistema inmunológico a menudo no totalmente pronunciado.

Puesto que los frotis de nariz y garganta no representan ningún material de prueba homogéneo, la tasa de positividad de una detección de gripe se determina junto con la calidad del frotis mediante la elución correcta, es decir, el paso del material del frotis a la fase líquida, que sirve como verdadero "material de prueba".

En especial debido a la nueva opción terapéutica (inhibidores de neuraminidasa) existirá en el futuro una necesidad creciente de detección de virus gripales (virus de la gripe A/B) en la consulta del médico o por el propio paciente, lo que con el actual material de prueba empleado (frotis, enjuague nasal)no está en consonancia con la necesidad de una toma de muestra por un personal adiestrado (médico).

Covalciuc y cois., Journal of Clinical Microbiology 37 (1999)3971-3974, comparan la idoneidad de cuatro materiales de prueba diferentes (aspirado nasal, exudado o frotis nasofaríngeo, exudado o extensión faríngea, esputo) para la detección de virus de la gripe A y B por medio de un inmunoanálisis óptico. Según el material de prueba empleado se obtiene por tanto diferente sensibilidad, especificidad y comparabilidad con las determinaciones en un cultivo de virus.

La WO 92/12256 propone un método y unos estuches de prueba o análisis para la detección de infecciones víricas. Para la detección de infecciones en las vías respiratorias se mencionan como materiales de prueba... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de una infección con el virus de la gripe A y/o B que Incluye los pasos

i) Obtención de una muestra de saliva;

ii) Preparación de la muestra de saliva para la detección; y

iii) Detección del virus de la gripe A y/o B en la muestra de saliva que se caracteriza por que la muestra de saliva que se obtiene en el paso i) es saliva formada espontáneamente, de manera que en la toma de la muestra de saliva no se realiza ningún enriquecimiento de virus en la muestra, sino que solamente se recoge la saliva que se encuentra en la boca de forma espontánea.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por que la muestra de saliva en el paso i) se obtiene con un dispositivo para obtener saliva sin enriquecimiento específico de virus.

3. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 2, que se caracteriza por que en el paso ii) se obtiene de la muestra de saliva el B-RNA de la gripe A y/o B, que se amplifica por medio de RT-PCR y se detecta en el paso iii).

4. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 2, que se caracteriza por que la muestra de saliva se analiza en el paso iii) siguiendo un método inmunológico para ver si existen virus de gripe A y/o B.

5. Método conforme a la reivindicación 4, que se caracteriza por que la muestra de saliva del paso ii) se trata con un tampón de lisis, de manera que se libera la nucleoproteina vírica del virus de la gripe A y/o B y esta nucleoproteína es detectada por un método inmunológico en el paso iii).

6. Utilización de la saliva como material de muestra para detectar una infección por el virus de la gripe A y/o B, que se caracteriza por que la saliva es saliva formada de manera espontánea, de modo que en la toma de muestra no se realiza ningún enriquecimiento de virus en la muestra sino que se recoge la saliva que se encuentra de forma espontánea en la boca.

7. Uso de la saliva conforme a la reivindicación 6, que se caracteriza por que la muestra de saliva se obtiene con un dispositivo para obtener saliva sin enriquecimiento específico de virus.

8. Uso de la saliva conforme a una de las reivindicaciones 6 hasta 7, que se caracteriza por que la detección de una Infección con el virus de la gripe A y/o B se realiza por medio de un ensayo inmunológico.

9. Uso de la saliva conforme a una de las reivindicaciones 6 hasta 7, que se caracteriza porque la detección de una infección por el virus de la gripe A y/o B se realiza por medio de la detección de ácido nucleico.