Método para la detección cualitativa y cuantitativa de trigo común.

Un método para detectar la presencia de trigo común en una muestra de interés,

cuyo método comprende: llevar a cabo un procedimiento operativo de PCR usando un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:5 y un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:6, con un ácido nucleico extraído de la muestra de interés que se usa como molde; y detectar la presencia de un producto de amplificación de PCR.

Método para la detección cualitativa y cuantitativa de trigo común Campo de la técnica La presente invención se refiere a un método que detecta específicamente trigo común que usa un procedimiento operativo de PCR. La presente invención se refiere específicamente a un método para la detección específica cualitativa y/o cuantitativa de trigo común existente en una mezcla de interés, p.ej., una materia prima alimenticia o un alimento procesado. La presente invención se refiere, además, a un método que puede determinar si el trigo existente en una mezcla de interés es trigo común o es un trigo distinto de trigo común, por ejemplo trigo duro, y que puede detectar la presencia tanto de trigo común como de trigo no común. La presente invención se refiere, además,

a un conjunto de cebadores, una sonda de ácidos nucleicos y un kit de detección para usar en los métodos de detección mencionados.

Antecedentes de la técnica Los consumidores tienen gran interés en las regulaciones acerca del etiquetado de alimentos y de sistemas junto a una serie de asuntos relacionados con la seguridad de los alimentos. El etiquetado de los alimentos ha llegado a ser 15 un asunto esencial en cuanto permite a los consumidores que evalúen y seleccionan por si mismos la calidad de los alimentos. El trigo se convierte en una diversidad de productos mediante varios procesos y también se distribuye en el mercado. El etiquetado de macarrones. que es un producto típico, está regulado por las Normas de Etiquetado de la Calidad de Alimentos Procesados y las Normas de Etiquetado de las Calidad de los Macarrones, y las expresiones “sémola de trigo duro”, “harina de trigo duro”, “farina de trigo fuerte” y “harina de trigo fuerte” se exponen en orden descendente de contenido de las harinas de trigo utilizadas como materia prima. Con exclusión de estudios de rastreo de procedimientos de producción, no existe tecnología alguna que sea capaz de discriminar cualitativa y/o cuantitativamente trigo común de trigo duro en tales alimentos de trigo procesados, y existe la exigencia del desarrollo de una tecnología tal..

Hasta la fecha, se han formulado métodos para la detección específica y altamente sensible de trigo empleando diversas tecnologías. Estos métodos pueden clasificarse, básicamente, en métodos que utilizan como diana de detección la proteína que deriva del trigo o el DNA existente en la muestra de interés.

Los métodos para la detección de la proteína pueden ser puestos de ejemplo por métodos electroforéticos, métodos de transferencia western y métodos inmunoquímicos, y por métodos que son combinaciones de los precedentes. En particular. los métodos ELISA han disfrutado de amplia aceptación comercial debido a la disponibilidad del equipo periférico y de reactivos.

No obstante, los linajes del trigo común y del trigo duro comparten una comunidad muy fuerte y sus respectivos componentes constituyentes son, por tanto, también bastante similares. La proteína no es, en este caso, una excepción y si bien existen diferencias en las proporciones de componentes proteínicos, casi no hay diferencias en los tipos de proteínas presentes en estos trigos. Por consiguiente, es bastante difícil discriminar entre trigo común y

trigo duro utilizando los niveles de proteínas.

Por otra parte, se han ideado también diversas tecnologías para la detección específica de trigo empleando PCR, que es una tecnología de amplificación técnica. Sin embargo, el análisis de DNA o de genes del trigo no siempre es totalmente adecuado y esto ha hecho bastante problemático el desarrollo de un método de ensayo óptimo.

El Documento No Patente 1, indica un método de detección de trigo que emplea PCR y que considera objetivo el

gen Wx-D1 codificado en el genoma D del trigo. Este método de ensayo es capaz de la detección con muy alta especificidad de trigo común y es óptimo para el ensayo de productos de trigo procesados tales como harinas de vegetales, de granos y harinas de trigo. El trigo duro, que carece del genoma D, no es detectado por este método de ensayo El Documento de Patente 1, por otra parte, describe un método basado en PCR que detecta cualitativa y/o 45 cuantitativamente trigo, y que tiene como objetivos el gen de la almidón sintetasa II (SSII) codificado en los genomas A, B y D del trigo. Este método de detección hace blanco en una región común de SSII A, B y D, y es capaz de la detección específica y altamente sensible de trigo. Un conjunto de cebadores que discrimina específicamente SSII-D está descrito en el Documento de Patente 1, pero la especificidad no está, necesariamente, asegurada y por tanto es inadecuado también para medidas cuantitativas.

El Documento No Patente 2, indica que el genoma de partida sufre un desdoblamiento físico en las etapas de tratamiento de alimentos de intensidad media o alta, tales como el calentamiento. Cuando la región diana de la amplificación de PCR existente en el genoma del trigo es grande, el acontecimiento de desdoblamiento en ese lugar ocasionado por la etapa de tratamiento puede evitar que el valor medido por PCR cuantitativa exprese el contenido real de trigo. Como resultado de ello, debe idearse una estrategia para reducir la posibilidad de que la región diana 55 de la PCR sufra fragmentación incluso cuando el genoma de trigo haya estado sometido a fragmentación debida a la aplicación al mismo de un tratamiento de intensidad media o alta.

Por consiguiente, existe el deseo de un método capaz de la detección altamente específica y altamente sensible de trigo común existente en una materia prima alimenticia o en un producto alimenticio procesado. Además, dado que todavía no existe un método adecuado para discriminar cualitativa y/o cuantitativamente entre trigo común y un trigo no común, y detectarlos, por ejemplo, trigo duro, en una materia prima alimenticia o en un alimento procesado,

existe la exigencia del desarrollo de un método tal de detección Documento de Patente 1: Solicitud de Patente japonesa abierta a la inspección pública, No. 2009-5588.

Documento No Patente 1: Iida, M. et al., Development of taxon-specific sequences of common wheat for the detection of genetically modified wheat. J. Agric. Food Chem., 53 (16) :6294-300, 10 Agosto (2005) .

Documento No Patente 2: Yoshimura, T. et al., Comparative studies of the quantification of genetically modifies organisms in foods processed from maize and soy using trial producing. J. Agric. Food Chem., 53 (6) :2060-9, marzo 23 (2005) .

Descripción de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un método específico y altamente sensible para detectar cualitativa y/o cuantitativamente trigo común en el trigo presente en una muestra de interés, p.ej., una materia prima alimenticia o un alimento procesado. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método que puede discriminar y detectar cualitativa y/o cuantitativamente entre trigo común y trigo no común, p.ej., trigo duro, existente en una materia prima alimenticia o un alimento procesado.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un conjunto de cebadores, una sonda de ácidos nucleicos y un kit de detección que puede emplearse en los métodos de detección mencionados que utilizan un procedimiento operativo de PCR.

Como resultado de investigaciones intensas y extensas con objeto de conseguir estos objetos, los inventores presentes han descubierto una secuencia de ácidos nucleicos específica en la almidón sintetasa II-D ubicada en el genoma D del trigo (abreviatura: SSII-D) y han descubierto también que podía conseguirse la detección específica y de alta sensibilidad, de trigo común en el trigo de una muestra de interés, diseñando un conjunto de cebadores basado en esta secuencia de ácidos nucleicos y llevando a cabo un procedimiento operativo de PCR utilizando este conjunto de cebadores. Además, con objeto de descubrir una sonda de ácidos nucleicos eficaz para poner en práctica un procedimiento operativo de PCR cuantitativa, los presentes inventores han diseñado una sonda de ácidos nucleicos especial que procede del interior de la secuencia de ácidos nucleicos de la región acotada por esta sonda situada sobre el gen SSII-D.

Los presentes inventores descubrieron también que era `posible discriminar entre trigo común y trigo no común, p.ej. trigo duro, existente en una muestra de interés, combinando el método de detección de trigo común mencionado, con un método para detectar una amplia gama de trigos mediante la detección específica y altamente sensible de una región común de la SSII ubicada en los genomas A, B y D del trigo, y llevando... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de trigo común en una muestra de interés, cuyo método comprende: llevar a cabo un procedimiento operativo de PCR usando un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:5 y un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:6, con un ácido nucleico extraído de la muestra de interés que se usa como molde; y detectar la presencia de un producto de amplificación de PCR.

2. Un método para detectar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de trigo común en una muestra de interés, cuyo método comprende: llevar a cabo un procedimiento operativo de PCR cuantitativa usando un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:5, un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:6, y una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11, con un ácido nucleico extraído de la muestra de interés que se usa como molde.

3. El método para detectar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de trigo común según la reivindicación 2, en donde la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11 es una sonda de ácidos nucleicos marcada, cuyo método comprende obtener una curva de amplificación monitorizando durante la PCR una señal que corresponde a la cantidad de un producto de amplificación generado por la sonda de ácidos nucleicos marcada.

4. El método según la reivindicación 2, en donde la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11 es una sonda de ácidos nucleicos marcada, cuyo método comprende obtener una curva de amplificación monitorizando durante la PCR una señal que corresponde a la cantidad de un producto de amplificación generado por la sonda de ácidos nucleicos marcada, y detectar cuantitativamente la presencia de trigo común usando una curva de calibración que ha sido construida por anticipado.

5. Un conjunto de cebadores que comprende un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:5 y un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:6.

6. Una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11.

7. La sonda de ácidos nucleicos según la reivindicación 6, que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:11, modificada por un fluoróforo en su extremo 5’-terminal y modificada por un desactivador de fluorescencia en su extremo 3’-terminal.

8. Un método para detectar la presencia de trigo común y/o un trigo distinto de trigo común existente en una muestra de interés, cuyo método comprende:

(1) preparar una muestra de ácido nucleico extrayendo un ácido nucleico de la muestra de interés, y

(a) detectar la presencia de trigo común llevando a cabo un procedimiento operativo de PCR cuantitativa que utiliza la muestra de ácido nucleico, un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:5, un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:6, y una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11 y obtener una curva de amplificación monitorizando una señal que corresponde a la cantidad de un producto de amplificación generado por la sonda de ácidos nucleicos, y

(b) detectar la presencia de trigo llevando a cabo un procedimiento operativo de PCR cuantitativa que utiliza la muestra de ácido nucleico, un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:9, un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:10, y una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:13 y obtener una curva de amplificación monitorizando una señal que corresponde a la cantidad de un producto de amplificación generado por la sonda de ácidos ; y

(2) comparar los resultados de (a) con los resultados de (b) .

9. El método según la reivindicación 8, que comprende:

(1) en (a) , obtener una curva de amplificación monitorizando una señal que corresponde a la cantidad de un 45 producto de amplificación generado por la sonda de ácidos nucleicos y detectar cuantitativamente la presencia de trigo común usando una curva de calibración que ha sido construida por anticipado. y

en (b) , obtener una curva de amplificación monitorizando una señal que corresponde a la cantidad de producto de amplificación generado por la sonda de ácidos nucleicos y detectar cuantitativamente la presencia de trigo usando una curva de calibración que ha sido construida por anticipado; y

(2) comparar el valor cuantitativo de (a) con el valor cuantitativo de (b) .

10. El método según la reivindicación 8 ó 9, en donde la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11 y la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:13, son sondas de ácidos nucleicos marcadas.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11 es una sonda de ácidos nucleicos modificada en su extremo 5’ terminal por un fluoróforo y modificada en su extremo 3’ terminal por un desactivador de fluorescencia, y la sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta por SEQ ID NO:13 es una sonda de ácidos nucleicos modificada en su extremo 5’ terminal por un fluoróforo y modificada en su extremo 3’ terminal por un desactivador de fluorescencia..

12. Un kit de detección de trigo común, que comprende un conjunto de cebadores con un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:5 y un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:6.

13. El kit de detección de trigo común según la reivindicación 12, que comprende, además, una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:11, que está modificada en su extremo 5’ terminal por un fluoróforo. y que está modificada en su extremo 3’ terminal por un desactivador de fluorescencia..

14. El kit de detección de trigo común según la reivindicación 13, que comprende, además, un conjunto de cebadores con un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:9 y un cebador que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:10, y una sonda de ácidos nucleicos que consiste en la secuencia de bases expuesta en SEQ ID NO:13 que está modificada en su extremo 5’ terminal por un fluoróforo y que está modificada en su extremo 3’ terminal por un desactivador de fluorescencia.