Método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno y método para determinar el índice de contaminación del trigo modificado genéticamente en una muestra de ensayo.

Un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo mediante unareacción en cadena de la polimerasa,

método que comprende:

usar una molécula de ácido nucleico en la muestra o una molécula de ácido nucleico extraída de lamuestra como molde para amplificar de forma específica la molécula de ácido nucleico de una regiónque consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 o una secuencia parcial dela misma, en la que la secuencia parcial presenta al menos 80 bases de largo, con un par de cebadorescapaz de amplificar esa región y detectar o cuantificar las moléculas de ácido nucleico amplificadas.

Método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno y método para determinar el índice de contaminación del trigo modificado genéticamente en una muestra de ensayo [0001] La presente invención hace referencia a un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo, y más concretamente, a un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno que ha de usarse cuando se determine el índice de contaminación del trigo modificado genéticamente contenido en un material alimentario o alimentos procesados.

En Japón, más de 50 variedades de cultivos modificados genéticamente (de aquí en adelante “organismo modificado genéticamente” u “OMG”) , entre los que se incluyen maíz, soja y patatas, han experimentado la 10 valoración de seguridad y se han aprobado para importación y venta. En consecuencia, un producto alimentario que contiene un OMG debe etiquetarse de acuerdo con las “Normas de etiquetado para alimentos modificados genéticamente publicadas por el Ministerio de agricultura, bosques y pesca que se establecieron de acuerdo con el artículo 7, párrafo 1 de las Normas de calidad de etiquetado para alimentos procesados y el artículo 7, párrafo 1 de las “Normas de calidad de etiquetado para alimentos frescos” (notificación nº 517 del Ministerio de agricultura, bosques y pesca, 31 de marzo de 2000) , y la “Aplicación de la ordenanza ministerial que corrige en parte la ordenanza ministerial sobre la aplicación de la ley de sanidad alimentaria, reglamentos y patrones composicionales, etc. para leche y productos lácteos” (Notificación nº 79 del Departamento de sanidad alimentaria, Oficina de seguridad médica y farmacéutica, Ministerio de sanidad, trabajo y bienestar, 15 de marzo de 2001) .

Sin embargo, en países extranjeros, los cultivos OMG pueden cultivarse en algunos casos conjuntamente con cultivos no OMG una vez se ha completado la evaluación de seguridad y puede aparecer contaminación después de la recolección durante el proceso de distribución. Los fabricantes de productos alimentarios y similares a menudo subcontratan la fabricación de alimentos procesados en plantas de fabricación, y aunque el contrato pueda estipular que debe usarse un material no OMG, pequeñas cantidades de un OMG pueden contaminar los alimentos procesados si también se usa un OMG en la misma planta. En consecuencia, para cumplir las obligaciones de etiquetado, los fabricantes de productos alimentarios deben examinar y analizar los productos alimentarios procesados finales para verificar que no están contaminados con un OMG.

Los métodos para detectar un OMG en una muestra de ensayo de un alimento procesado, la materia prima del mismo, etc. incluyen la detección de ADN recombinante por la reacción en cadena de la polimerasa (de aquí en adelante “PCR”) y la detección de una proteína recombinante por ELISA. Sin embargo, en el caso de alimentos procesados, las proteínas a menudo se han desnaturalizado por el calor y la presión y no pueden detectarse con exactitud por ELISA. Por lo tanto, normalmente se emplea la detección por PCR.

Los métodos de análisis de laboratorio incluyen los métodos descritos en el Manual de análisis analítico según la norma agrícola japonesa (JAS Analytical Test Handbook) , “Genetically Modified Food Test and Analysis 35 Manual for Individual Products”, segunda edición revisada (Documento que no es una patente 1) y los descritos en “Testing for Foods Produced by Recombinant DNA Techniques” (revisado parcialmente) (Notificación nº 0618002 del Departamento de sanidad alimentaria, Ministerio de salud, trabajo y bienestar, 18 de junio de 2003) . Estos documentos describen que, en el ensayo y análisis de un OMG, es necesario efectuar la PCR usando un par de cebadores que reconozca el ADN endógeno de cada producto agrícola y verificar que se obtiene un producto de PCR de la longitud esperada, para verificar que el ADN extraído de la muestra de ensayo puede amplificarse mediante PCR. Cuando se cuantifica un OMG contenido en una muestra de ensayo, se usa el método de medir el índice de contaminación del cultivo modificado basándose en la ratio de ADN recombinante y ADN endógeno que está siempre presente en ese cultivo.

En el caso del maíz, por ejemplo, se han desarrollado pares de cebadores que reconocen cada una de 45 las 5 cepas de variedades de OMG aprobadas, junto con un par de cebadores que reconoce la región génica SSIIB como ADN de maíz endógeno (Documento que no es un patente 1) .

En “Testing for Foods Produced by Recombinant DNA Techniques (revisado parcialmente) ” (notificación nº 1113001 del Departamento de sanidad alimentaria, Ministerio de salud, trabajo y bienestar, 13 de noviembre de 2003) , durante el proceso de ejecución de la PCR cuantitativa, los productos de amplificación amplificados por

pares de cebadores específicos dirigidos a ADN endógeno y a ADN recombinante de maíz o soja están ligados a un plásmido y se usan como material de referencia estándar. Al llevar a cabo la PCR utilizando este material de referencia estándar, la ratio del número de copias de ADN recombinante y el número de copias de ADN endógeno puede determinarse de forma exacta en una muestra de ensayo mediante PCR cuantitativa de tiempo fijo.

Cuando existe una pluralidad de cepas de OMG, como en el caso del maíz, es una técnica particularmente útil usar un material de referencia estándar común para medir el índice de contaminación de cada cepa, lo cual puede realizarse usando un material de referencia estándar que tiene ADN endógeno y ADN específico de cada cepa incorporado a una sola molécula de ADN circular.

Es generalmente difícil obtener genes específicos de cada cepa, pero una vez se ha preparado el ADN replicable que incorpora estos genes, se puede proporcionar de forma estable ADN específico de la cepa 5 mediante la replicación del mismo.

Aunque ningún producto modificado genéticamente de trigo común ha pasado todavía la valoración de seguridad, se espera que aparezcan en el mercado en el futuro próximo. En consecuencia, tienen que desarrollarse métodos para detectar y cuantificar ADN de trigo endógeno y pares de cebadores de PCR para usarse en dichos métodos con el fin de prepararse para la distribución de trigo OMG.

Las formas de los genes encontrados en trigo presentan diversas variaciones comparados con otros granos. Esto se debe a que los genotipos diploides, tetraploides y hexaploides aparecen dependiendo de la variedad del trigo. Por ejemplo, el trigo común general es hexaploide (AA, BB, DD) y aunque cada uno de los genes es similar, se encuentran diferencias parciales debido a la translocación y similares. Por otro lado, el trigo duro es tetraploide y no contiene DD genómico.

En términos de su estructura genómica y la secuencia nucleotídica de sus genes codificados, el trigo comparte un alto grado de homología con otros granos de cereales tales como cebada, centeno y avena. Estos granos tienen un alto nivel de homología con el trigo común y, por lo tanto, la posibilidad de una falsa detección es alta.

Bajo estas circunstancias, ha sido difícil encontrar en el trigo una secuencia de ADN que cumpla las siguientes cuatro condiciones: a) está presente universalmente en las variedades de trigo; b) la cantidad presente (cantidad detectada) no se verá afectada dependiendo de la variedad de trigo; c) incluso aunque existan otros granos, solo se detectará el trigo sin reactividad cruzada y d) se amplificará de forma cuantitativa mediante la reacción PCR.

WO 2005/097989 (Documento de patente 1) revela que una secuencia parcial del gen Waxy (véase el

documento que no es una patente 2) , etc., puede usarse como ADN de trigo endógeno que cumple tales condiciones. Documento de patente 1: WO 2005/097989 Documento que no es una patente 1: JAS Analytical Test Handbook, "Genetically Modified Food Test and Analysis Manual for Individual Products, Segunda edición revisada"

Documento que no es una patente 2: Ainsworth C, et al., Plant Mol Biol. 1993 abril;22 (1) :67-82

Divulgación de la invención [0015] Sin embargo, el trigo céreo, un mutante que carece del gen Waxy ya se conoce y en muestras de ensayo que contienen trigo céreo es imposible analizar el ADN de trigo endógeno de forma exacta detectando la secuencia parcial del gen Waxy expuesto en el documento de patente 1. Además, puesto que se cree que el gen Waxy está presente en el genoma D del trigo, no estará presente en el genoma de trigo duro, que carece del genoma D. Por lo tanto, aunque el método expuesto en el documento de patente 1 es útil cuando el... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar o cuantificar ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo mediante una reacción en cadena de la polimerasa, método que comprende:

usar una molécula de ácido nucleico en la muestra o una molécula de ácido nucleico extraída de la muestra como molde para amplificar de forma específica la molécula de ácido nucleico de una región que consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 o una secuencia parcial de la misma, en la que la secuencia parcial presenta al menos 80 bases de largo, con un par de cebadores capaz de amplificar esa región y detectar o cuantificar las moléculas de ácido nucleico amplificadas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la región que consiste en la secuencia parcial de la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 es una región consistente en cualquiera de las secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NOs: 11 a 18.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el par de cebadores es un par de cebadores elegido de un grupo que consiste en:

(i) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 4;

(ii) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 5 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 4;

(iii) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 6;

(iv) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 5 y una molécula de ácido nucleico que comprende la 25 secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 6;

(v) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 7;

(vi) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de

nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 8;

(vii) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 5 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 8;

(viii) un par de cebadores consistente en una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 5 y una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 7;

(ix) un par de cebadores consistente en un par de moléculas de ácido nucleico donde cada molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos en común con al menos un 80 % de secuencia de nucleótidos continua de cada molécula de ácido nucleico en los pares de cebadores (i) a (viii) anteriores.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en el que cada cebador en el par de cebadores es una molécula de ácido nucleico que presenta de 15 a 40 bases de largo.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en el que la región amplificada en la 45 reacción en cadena de la polimerasa se detecta usando una sonda identificada como SEQ ID NO: 9 o 10.

6. Un kit para detectar o cuantificar una secuencia de ADN de trigo endógeno en una muestra de ensayo mediante la reacción en cadena de la polimerasa, que contiene al menos un par de cebadores de los pares de cebadores según la reivindicación 3.

7. Un vector de ADN que comprende:

una secuencia de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 o una secuencia parcial de la misma como ADN endógeno común tanto para trigo modificado genéticamente como para trigo no modificado genéticamente y una o más secuencias de ADN que comprenden secuencias que son específicas de cada cepa de trigo modificado genéticamente como ADN específico de trigo modificado genéticamente.

8. Vector de ADN que comprende:

una secuencia de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que presenta al menos un 80 % de homología con el ADN consistente en la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 o una secuencia parcial de la misma como ADN endógeno común tanto para trigo modificado genéticamente como para trigo no modificado genéticamente y una o más secuencias de ADN que consisten en secuencias que son específicas de cada cepa de trigo modificado genéticamente como ADN específico de trigo modificado genéticamente.

9. Vector de ADN según la reivindicación 7 u 8, en el que el ADN consistente en la secuencia parcial de la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 2 es ADN consistente en cualquiera de las 10 secuencias de nucleótidos identificadas como SEQ ID NOs: 11 a 18.

10. Vector de ADN que comprende:

ADN consistente en una secuencia capaz de ser amplificada mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cualquiera de los pares de cebadores según la reivindicación 3 como ADN endógeno común tanto para trigo modificado genéticamente como para trigo no modificado genéticamente y una o más secuencias de ADN que consisten en secuencias que son específicas de cada cepa de trigo modificado genéticamente como ADN específico de trigo modificado genéticamente.

11. Método para determinar un índice de contaminación del trigo modificado genéticamente en una muestra de ensayo, método que comprende:

una etapa que consiste en preparar dos o más tipos de series de diluciones de concentraciones de soluciones que contienen ADN según cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 10, llevar a cabo reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas para cada uno, amplificar el ADN de trigo endógeno y al menos un tipo del ADN específico de trigo modificado genéticamente y determinar una curva de calibración para cada región parcial;

una etapa que consiste en llevar a cabo, para la muestra de ensayo, una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa bajo las mismas condiciones que en la etapa para la determinación de las curvas de calibración y determinar el número de moléculas de ADN de trigo endógeno y el número de moléculas de ADN específico de trigo modificado genéticamente presentes en la muestra de ensayo usando la curva de calibración,

donde la amplificación del ADN de trigo endógeno se lleva a cabo usando al menos un par de cebadores elegido de los pares de cebadores según la reivindicación 3 y una etapa que consiste en determinar el índice de contaminación del trigo modificado genéticamente en la muestra de ensayo mediante el cálculo de una fórmula 100*A/B usando:

una ratio A obtenida al dividir el número de moléculas de ADN específico de trigo modificado genéticamente por el número de moléculas de ADN de trigo endógeno presentes en la muestra de ensayo y una ratio B obtenida al dividir el número de moléculas de ADN específico de cada cepa de trigo modificado genéticamente determinado al llevar a cabo reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas usando las semillas estándares de cada cepa de trigo modificado genéticamente por el

número de moléculas de ADN de trigo endógeno.