Método para el diagnóstico de la enfermedad de parkinson en estadios tempranos.

Método para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson en estadios tempranos.

La presente invención se relaciona con un método in vitro para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson que comprende la cuantificación en sangre, suero o plasma de los niveles de nitro-α-sinucleína nitrosilada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136. Asimismo, también se relaciona con un método para evaluar la eficacia de la terapia administrada a un individuo que padece la enfermedad de Parkinson y con el uso de anticuerpos específicos de los residuos Tyr125 y/o Tyrl36 y/o Tyr39 nitrosilados de la nitro-α-sinucleína o de inhibidores de la oxido nítrico sintasa en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON EN ESTADíos TEMPRANOS

CAMPO DE LA INVENCiÓN La presente invención se relaciona con un método para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson que comprende la cuantificación en sangre, suero o plasma de los niveles de nitro-a-sinucleína nitrosilada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136. Asimismo, también se relaciona con el uso de anticuerpos específicos de los residuos Tyr125 y/o Tyr136 y/o Tyr39 nitrosilados de la nitro-a-sinucleína en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, la presente invención se incluye dentro del

campo de la biomedicina, en particular, en el diagnóstico de las enfermedades neurodegenerativas mediante el empleo de biomarcadores y en el tratamiento de las mismas.

ESTADO DE LA TÉCNICA La enfermedad de Parkinson es un trastorno que afecta las células nerviosas principalmente en una parte del cerebro que controla los movimientos musculares (circuito nigroestriado) . En la enfemnedad de Parkinson, las neuronas que producen una sustancia química llamada dopamina mueren o no funcionan adecuadamente. Normalmente, la dopamina envía señales que ayudan a coordinar los movimientos. Los síntomas de la enfermedad de Parkinson pueden incluir temblor en las manos, los brazos, las piernas, la mandíbula y la cara,

rigidez en los brazos, las piernas y el tronco, lentitud de los movimientos y problemas de equilibrio y coordinación. La enfemnedad de Parkinson se clasifica en estadios clínicos según el grado de afectación que van de grado 1 a grado 5 (Hoehn MM y Yahr MD. Parkinsonism: onse/, progression and mortali/y; Neurology, 17: 427-442) .

El estrés oxidativo se debe a un desequilibrio entre la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) y los mecanismos de defensa antioxidante. El estrés oxidativo está presente en la enfermedad de Parkinson, y se ha postulado como uno de los fenómenos fisiopatológicos relacionados con el

desarrollo de la enfermedad (Jenner, P. 2003. Oxidative stress in Parkinson's disease. Ann Neurol, 53, SuppI.3:S26-36) . Dicho estrés se evidencia en suero y

líquido cefalorraquídeo de los enfermos, así como en muestras de tejido analizadas hasta la fecha. Entre los tipos de estrés oxidativo se encuentra la nitración, en el que hay modificaciones oxidativas de proteínas secundarias al exceso de óxido nítrico. La nitración de residuos de tirosina es el cambio más prominente y se asocia a diversas patologías humanas, tales como las alfa

sinucleopatías entre las que se incluyen la enfermedad de Parkinson.

Entre las proteínas nitradas destaca la a-sinucleína, que es un componente principal de los cuerpos de Lewy. Las inclusiones de a-sinucleína en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Parkinson se pueden marcar con anticuerpos 15 anti-3-nitrotirosina, lo que indica que la o-sinucleína es diana de nitración y se convierte en nitro-a-sinucleína. Esta proteína contiene 140 aminoácidos con cuatro residuos de tirosina (Tyr39, Tyr125, Tyr133, Tyr136) que son accesibles a la nitración. La nitración en Tyr39 y/o Tyr125/136 aumenta la agregación de la asinucleína (paxinou E. el al. 2001. Induclion of a/pha-synuclein aggregalion by 20 intracelu/ar nilrative insull. J Neurosci. 21 (20) : 8053-61) , y hay evidencias que la conversión de la Q-sinucleína desde su forma soluble en forma agregada insoluble es un factor crucial en la enfermedad de Parkinson (Yanamandra k. el al. , 2011. asynuclein reaclive antibodies as diagnoslic biomarkers in blood será of Parkinson's Disease palienls. PLoS One, 6 (4) :e18513) . Finalmente, la nitración 25 conjunta de residuos en el carboxilo terminal más la de Tyr39 en el amino terminal origina una proteína altamente citotóxica que acelera la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (Benner E.J. el al., 2008. Nilraled alpha-synuclein immuni/y acce/erales degenera/ion o, nigra/ dopaminergic neurons. PLos One,

(1) :e1376) , e induce la muerte de neuronas en cultivo (tipo SH-SYSYS; Shavali et al., 2006. Reactive macrophages increase oxidative stress and alpha-synuclein nitralion during dealh of dopaminergic neuronal ce/ls in co-cullure: rekevance lo Parkinson's disease. Neurochem Res. 31 (1) :85-94; Liu et al., 2011 . Novel molecular mechanism for nitrated alpha-synuclein induced celf death. J. Mol Cell Biol. 3 (4) : 239-49) .

Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson puede llegar a revestir una gran complejidad. Esta dificultad en la diagnosis es corriente que aparezca en los primeros estadios de la enfermedad, cuando los síntomas que el paciente presenta pueden ser atribuidos a otros trastornos. Consecuencia directa de este hecho es la elaboración de diagnósticos erróneos.

No existe ninguna prueba de laboratorio o estudio radiológico que permita diagnosticar la enfermedad, aunque algunas empresas de diagnósticos genéticos ofrecen test para la secuenciación de los genes SPARK1 , SPARK2 y SPARK4 altamente relacionados con la enfermedad, aunque la detección de mutaciones en estos genes no determina el futuro desarrollo de la enfermedad en el individuo, y

solo estaría indicado en formas familiares de la enfermedad de Parkinson. También es frecuente que se realicen analíticas sanguíneas con el objetivo de descartar otros posibles trastornos que al igual que la enfermedad de Parkinson conllevan una ralentización en los movimientos.

Actualmente, las investigaciones dirigidas al desarrollo de métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson van encaminadas a encontrar biomarcadores que sean indicativos de la presencia de la enfermedad y ayuden a un mejor y más temprano diagnóstico de la misma.

Así, la solicitud de patente internacional W02011/152699 describe un método para el diagnóstico temprano de la enfermedad de Parkinson basado en el estudio de la formación de quinonas de dopamina y la detección por voltamperometría cíclica de metabolitos oxidados de la dopamina en el plasma de pacientes que presentan síntomas tempranos de la enfermedad.

La solicitud de patente internacional W02012/056451 describe un método para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson en un sujeto mediante el empleo de un perfil establecido a partir de la expresión de ciertos genes en la sangre

periférica de dicho individuo.

La solicitud de patente W02012/104696 describe anticuerpos que tienen alta afinidad por las protofibrillas de alfa-sinucleina humana pero baja afinidad por los monómeros de alfa-sinucleina y su uso en el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson.

La solicitud de patente W02012/101228 describe el uso del patrón de metilación del gen alfa-sinucleína en el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson a partir del análisis del ADN procedente de monocitos de sangre periférica.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos marcadores alternativos a

los que ya existen en el estado de la técnica , que permitan diagnosticar la enfermedad de Parkinson en estadíos tempranos de la enfermedad con fiabilidad.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN los autores de la presente invención han observado que los niveles en sangre de 20 proteína nitro-o-sinucleína nitrasiJada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136 están aumentados en sujetos que padecen la enfermedad de Parkinson (EP) en grados 1 Ó 2 de la escala de Hoehn-Yahr respecto a sujetos sanos.

Tal como se muestra en el ejemplo de la presente descripción, los inventores detectaron signos de estrés oxidativo, en concreto, estrés nitrativo en sangre de los enfermos de Parkinson de grados 1 ó 2 de Hoehn-Yahr, observando que los niveles de proteínas nitrasiJadas estaban incrementados en pacientes respecto a controles sin afectar a los niveles de nitroalbúmina. Tras eliminar todas las proteínas mayores de 60 KDa, se detectó mediante western blotting (tanto en 30 enfermos como en controles) una banda de alrededor de 56 KDa de proteína

nitrasiJada que correspondía a la a-sinucleína en estructura tetramérica.

Posteriormente, empleando anticuerpos selectivos para detectar nitrosilación en residuos concretos de la nitro-a-sinucleína, se observó que la proteína nitro-a

sinucleína nitrasilada en los residuos Tyr125 ylo Tyr136 estaba aumentada en enfennos de Parkinson respecto a sujetos sanos. Mediante análisis estadísticos (ANOVA) , se vio que dicho incremento se producía en enfermos de Parkinson en grados 1 ó 2 de Hoehn-Yahr (Figura 3) . También se detectó un decremento en la proteína nitro-a-sinucleína nitrosiJada en el residuo Tyr39, aunque no es significativo en el grupo de pacientes en grados tempranos. Por... [Seguir leyendo]

1. Un método para el diagnóstico in vi/ro de la enfermedad de Parkinson en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahren un individuo que comprende (a) Cuantificar los niveles de nitro-a-sinuclelna nitrasilada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136 en una muestra de sangre, suero o plasma de dicho individuo y

(b) Comparar los niveles obtenidos con un valor de referencia.

2. Método según la reivindicación 1, en el que si el nivel de nitra-a-sinuc!eína nitrosilada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136 es mayor que el valor de referencia, entonces dicho individuo padece la EP en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahr.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, que además comprende

(e) cuantificar los niveles de nitro-o-sinucleína nitrosilada en el residuo Tyr39

respecto a un valor de referencia y

(d) calcular el ratio nítro-a-sinucleína nitrasilada en los residuos Tyr125 y/o Tyr136 en relación con la nitra-a-sinuc!eína nitrasilada en el residuo 20 Tyr39.

4. Método según ta reivindicación 3, en el que si el ratio es mayor de 1, 6, en particular, mayor de 1, 8, entonces el individuo padece la enfermedad de Parkinson en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahr.

5. Método según cualquiera de tas reivindicaciones 1 a 4, en el que el individuo

es un mamífero, en particular, un primate, más en particular, un ser humano.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cuantificación de los niveles de nitra-a-sinucleína nitrasilada se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos.

7. Un método para evaluar in vi/ro la eficacia de la terapia administrada a un individuo que padece la enfermedad de Parkinson EP en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahr que comprende

(a) Cuantificar los niveles de nitro-a-sinucleina nitrosilada en los residuos Tyr125 ylo Tyr136 en una muestra de sangre, suero o plasma de dicho individuo, y

(b) Comparar los niveles obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia.

8. Método según la reivindicación 7, en el que si el nivel de nitro-a-sinucleina nitrosilada en los residuos Tyr125 ylo Tyr136 es mayor que el valor de referencia, entonces la terapia administrada no está siendo eficaz.

9. Método según la reivindicación 7 u 8, que además comprende (c) cuantificar los niveles de nitro-a-sinucleina n~rosilada en el residuo Tyr39

respecto a un valor de referencia y

(d) calcular el ratio nitro-a-sinucleína nitrosilada en los residuos Tyr 25 ylo Tyr136 en relación con la nitro-a-sinucleína nitrosilada en el residuo Tyr39.

10. Método según la reivindicación 9, en el que si el ratio es mayor de 1, 6 en particular, mayor de 1, 8, entonces la terapia administrada no está siendo eficaz.

11.Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la terapia administrada se selecciona del grupo que consiste en levodopa,

bromocriptina, lisurida, pramipexol, repirinol, cabergolina, selegilina, amantadina, bezatropina. anticuerpos que reconocen específicamente los residuos Tyr39 ylo Tyr125 ylo Tyr136 nitrosilados de la nitro-a-sinucleína, un inhibidor de la oxido nitrico sintasa y combinaciones de los mismos.

12. Método según la reivindicación 11 , en el que el inhibidor de la oxido nitrico sinlasa se selecciona del grupo que consiste en S- (2-aminoetil} isotiourea (AE-ITU) , 1-N' (1-iminoetil) -ornitina, clorohidrato de aminoguanidina, clorohidrato de 2-Amino-5, 6-dihidro-6-metil-4H-1 , 3-tiazina, clorohidrato de 5[ (4' -Amino-5'.

8. difluorospiro[piperidina-4, 2' ( 1 'H) -quinaxolin]-1-il) carbonil]-2piridinecarbonitrilo, diclorohidrato de 2-[2- (4-Metoxi-2-piridinil) etil]-1 Himidazo[4, 5-b] piridina, bromohidrato de (S) -Etilisotiourea, clorohidrato de 2Iminopiperidina, bromohidrato de S-Isopropylisotiourea, sulfato de (S) Metilisotiourea, Clorohidrato de N"- (1 -lminoetil) -L-lisina, diclorohidrato de N[[3- (Aminometil) phenil]metil]-etanimidamida, diclorohidrato de N'- (1-lminoetil) L-ornitina, Nw-Nitro-L-arginina (L-NIO clorohidrato) , clorohidrato de L-N6- (1Iminoetil) lisina, sal de acetato de NG-Hidroxi-L-arginina (sal de acetato NOHA) , aminoguanidina, Hemisulfato, 1-Amino-2-hidroxiguanidina, pToluensu~ato, dexametasona, diclorohidrato de NG, NG-Dimethil-L-arginina, cloruro de difenileneiodonium, 2-etil-2-thiopseudourea, haloperidol, L_N5_ (1 _ Iminoetil) ornitina, S-Metilisotiourea su~ato, S-metil-L-tiocitrulina, NG-MonoetilL-arginina sal de monoacetato, NG-Monometil-L-arginina Monoacetato (LNMMA) , L-NIL, NG-Nitro-L-arginina (L-NNA) , 7-Nitroindazol, 7-Nitroindazol sal de sodio, 7-Nitroindazol, 3-Bromo-sal de sodio, L-Tiocitrullina, NG-Propil-Larginina, Nw-Nw-dimetil-L-arginina (L-ADMA) , doxiciclina, minociclina, tetraciclina y combinaciones de los mismos.

13.Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que el individuo es un mamífero, en particular, un primate, más en particular, un ser humano.

14.Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que la cuantificación de los niveles de nitro-o-sinucleína nitrada se lleva a cabo mediante el empleo de anticuerpos.

15. Uso de un kit que comprende anticuerpos que reconocen específicamente los residuos Tyr125 y/o Tyr136 y/o Tyr39 nitrosilados de la nitro-a-sinucleina para el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Parkinson en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahr, o para evaluar in vitro la eficacia de la terapia administrada a un individuo que padece la enfermedad de Parkinson EP en grado 1 ó 2 según la escala Hoehn-Yahr.

16.Uso según la reivindicación 15, en el que la terapia administrada se selecciona del grupo que consiste en levodopa, bromocriptina, lisurida, pramipexol, ropirinol, cabergolina, selegilina, amantadina, bezatropina, anticuerpos que reconocen especificamente los residuos Tyr39 y/o Tyr125 y/o Tyr136 nitrosilados de la nitro-a-sinucleina, un inhibidor de la oxido nitrico sintasa y combinaciones de los mismos.

17.Uso según la reivindicación 16, en el que el inhibidor de la oxido nitrico sintasa se selecciona del grupo que consiste en S- (2-aminoetil) isotiourea (AE-ITU) , 1-N" (I-iminoetil) -ornitina, clorohidrato de aminoguanidina, c\orohidrato de 2-Amino-5, 6-dihidro-6-metil-4H-1, 3-tiazina, c\orohidrato de 5[ (4'-Amino-5'.

8. difluorospiro[piperidina-4, 2' ( 1 'H) -quinaxolinJ-1-il) carboniIJ-2piridinecarbonitrilo, dic\orohidrato de 2-[2- ( 4-Metoxi-2-piridinil) eti IJ-1 Himidazo[4, 5-bJ piridina, bromohidrato de (S) -Etilisotiourea, clorohidrato de 2Iminopiperidina, bromohidrato de S-Isopropylisotiourea, sulfato de (S) Metilisotiourea, Clorohidrato de N"- (I-lminoetil) -L-lisina, dic\orohidrato de N[[3- (Aminometil) pheniIJmetiIJ-etanimidamida, diclorohidrato de N"- (I-lminoetil) L-ornitina, Nw-Nitro-L-arginina (L-NIO clorohidrato) , c\orohidrato de L_N6_ (I_ Iminoetil) lisina, sal de acetato de NG-Hidroxi-L-arginina (sal de acetato NOHA) , aminoguanidina, Hemisulfato, 1-Amino-2-hidroxiguanidina, pToluensulfato, dexametasona, diclorohidrato de NG, NG-Dimethil-L-arginina, cloruro de difenileneiodonium, 2-eti~2-thiopseudourea, haloperidol, L_N5_ (I_ Iminoetil) ornitina, S-Metilisotiourea suKato, S-metil-L-tiocitrulina, NG-MonoetilL-arginina sal de monoacetato, NG-Monometil-L-arginina Monoacetato (LNMMA) , L-NIL, NG-Nitro-L-arginina (L-NNA) , 7-Nttroindazol, 7-Nitroindazol sal de sodio, 7-Nitroindazol, 3-Bromo-sal de sodio, L-Tiocitrullina, NG-Propil-L

arginina, Nw-Nw-dimetil-L-arginina (L-ADMA) , doxiciclina, minociclina,

tetraciclina y combinaciones de los mismos.