Método de síntesis de oligómeros de morfolino.

Un compuesto de morfolino que tiene la estructura siguiente**Fórmula**

en donde:

R1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo inferior, di(alquil inferior)5 amino y fenilo;

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo inferior, arilmetilo monocíclico y (ariloxi)metil monocíclico;

R3 se selecciona del grupo que consiste en triarilmetilo e hidrógeno; e

Y se selecciona del grupo que consiste en: un grupo hidroxilo o amino protegido o no protegido; un grupo clorofosforamidato; y un enlace fosforodiamidato al nitrógeno del anillo de morfolino de otro compuesto de morfolino, un enlace fosforodiamidato al nitrógeno del anillo de morfolino de una subunidad de morfolino en un oligómero de morfolino o un soporte sólido;

en donde la expresión alquilo inferior define un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono;

con tal que el compuesto no tenga la siguiente estructura:**Fórmula**

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DESCRIPCIÓN

Método de síntesis de oligómeros de morfolino Campo de la invención La invención se refiere a métodos para sintetizar oligómeros de morfolino con fosforodiamidato ligado por acoplamiento de monómeros de subunidades de morfolino, y en particular, a la mejora de los procedimientos para la desprotección del nitrógeno del anillo morfolino protegido en cada etapa de acoplamiento, y a la utilización de subunidades de guanina morfolino (MoG) con protección tanto en los grupos N2 como en los 06/N1 de la base guanina. Los oligómeros de morfolino sintetizados que utilizan estas modificaciones se obtienen con mayor pureza y rendimiento en comparación con los sintetizados utilizando subunidades de guanina monoprotegidas y/o procedimientos de desprotección de nitrógeno del anillo convencionales.

Referencias Albert, A., Physical Methods in Heterocyclic Chemistr y , Vol. I, A. R. Katritzky, Ed., Academic Press, págs. 44 (1963) .

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Ravikumar, V. et al., patente de EE.UU. nº 5.510.476.

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Summerton, J.E. y Weller, D.D., Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 7 (3) :187-195 (1997) .

Antecedentes Los oligómeros de morfolino con fosforodiamidato ligado, u OMP, son análogos de ácidos nucleicos que se unen fuertemente y la secuencia específicamente al ARN complementario y que son útiles en la modulación de la síntesis de proteínas y por lo tanto de la expresión génica. Estos oligómeros se componen de restos de reconocimiento de emparejamiento de bases (bases heterocíclicas) con el apoyo de un sistema troncal de morfolino. Las subunidades de morfolino para su utilización en la síntesis de dichos oligómeros se pueden preparar fácilmente a partir de los ribonucleósidos correspondientes, que están fácilmente disponibles y de precursores económicos (véase p. ej., Summerton y Weller, 1993, 1997) .

Durante dicha síntesis, como en la síntesis convencional de oligonucleótidos, los grupos funcionales en las bases heterocíclicas suelen estar enmascarados para evitar la interferencia en las transformaciones sintéticas. Por ejemplo, la activación del monómero N-morfolino tritilado (1a-f; Figura 1) conlleva la reacción del 5'-hidroxilo con un fosforamido diclorurato adecuado para formar la subunidad activada 2a-f. A gran escala (reactor de 50-100 galones) , la subunidad activada en bruto generalmente se contamina con un alto nivel de subproductos. Después de la purificación cromatográfica, la subunidad activada se aísla con un rendimiento de aproximadamente 50% para A, C, 1, T, U y sus formas protegidas, pero sólo con un rendimiento de aproximadamente 5% para la subunidad G activada individualmente protegida, lo que se cree que es debido a la presencia del oxígeno 06 sin protección.

La subunidad guanina con 06 sin protección también da lugar a reacciones secundarias en la etapa de oligómero. Por ejemplo, el oxígeno 06 puede reaccionar con la subunidad activada durante las etapas de acoplamiento, para formar especies 06 fosforiladas o derivados, y durante la escisión final de grupos protectores de la base con amoníaco, el amoníaco puede reaccionar en C6 para desplazar estas especies, dando un derivado de diaminopurina. Dichas impurezas son difíciles de eliminar por cromatografía, y originan una gran pérdida de rendimiento.

Se han propuesto varios esquemas de protección en la técnica para reducir las reacciones secundarias de las posiciones de guanina con 06 sin protección en la síntesis convencional de oligonucleótidos (véase, por ejemplo

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Gough et al. 1979; Reese et al. 1981, 1984; Jones et al. 1982A, 1982B) . Sin embargo, estos protocolos no tuvieron éxito en gran medida cuando se aplican a la síntesis de OMP. Por consiguiente, se buscan métodos mejorados para aumentar el rendimiento y la pureza en la síntesis de OMP, en particular en la utilización de subunidades de morfolino G.

El nitrógeno del morfolino de una subunidad de morfolino también está protegido antes de su uso, normalmente con una especie de tritilo o tritilo sustituido. Durante la síntesis de oligómeros, este grupo debe ser eliminado durante cada ciclo para permitir la incorporación de la siguiente subunidad. Si no se retira completamente el grupo protector conduce a secuencias de eliminación de N-1 que contaminan el producto oligomérico deseado.

Los grupos tritilo se eliminan convencionalmente con ácido, y los reactivos de desprotección utilizados para la síntesis de OMP han sido tradicionalmente los ácidos carboxílicos (Summerton et al. 1993, 1997) . Sin embargo, los grupos de fosforodiamidato también son sensibles a ácidos, y los ácidos carboxílicos útiles para destritilación también pueden promover la hidrólisis de enlaces fosforodiamidato a especies de amidato, como se muestra en la Fig. 1, con la posibilidad de degradación más extensa del eje central. Por ejemplo, el ácido cianoacético en acetonitrilo al 20%/DCM es un reactivo de desprotección efectiva, pero se constata que causa hidrólisis sustancial (5-10%) de enlaces fosforodiamidato en el producto OMP.

Los ácidos carboxílicos también deben ser eliminados completamente de la resina soporte de la síntesis antes de la reacción de acoplamiento; de otro modo, se forman subproductos que consisten en oligómeros truncados que contienen una especie 3'-acilada.

El documento US nº 5.185.444 (A) describe una composición polimérica que comprende: estructuras de subunidades de morfolino unidas por enlaces quirales, sin carga, de uno a tres átomos de longitud. Estos enlaces quirales se unen al nitrógeno del morfolino de una subunidad al carbono 5' exocíclico de una subunidad adyacente. Cada subunidad contiene un resto de emparejamiento de bases purínicas o pirimidínicas eficaz para unir por enlace de hidrógeno a una base específica o a un par de bases en un polinucleótido objetivo.

El documento US 2007/135333 (A1) se refiere a un conjugado complementario antibacteriano y a un método de utilización del mismo para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero anfitrión. El conjugado comprende un oligonucleótido complementario sustancialmente sin carga conjugado concentración un péptido portador que aumenta significativamente la actividad bacteriana del oligonucleótido. El oligonucleótido complementario contiene 10 a 20 bases nucleotídicas y tiene una secuencia objetivo de ácido nucleico complementaria con una secuencia objetivo que contiene dentro de diez bases, en dirección aguas abajo, del codón de partida de la traducción de un ARNm bacteriano que codifica una proteína bacteriana esencial para la multiplicación bacteriana, donde el compuesto se une a un ARNm diana con una Tm entre 50º a 60º C. El péptido portador es un péptido rico en arginina que contiene entre 6 y 12 aminoácidos.

El documento WO 2008/008113 (A1) describe un método para aumentar la actividad antibacteriana de un oligonucleótido complementario compuesto de subunidades de morfolino unidas por enlaces entre las subunidades que contienen fósforo. El método comprende uno o ambos de los siguientes: conjugar un portador rico en arginina con el extremo 3' o 5' del oligonucleótido y modificar el oligonucleótido para que contenga 20% a 50% de enlaces entre las subunidades que están positivamente cargadas a pH fisiológico.

El documento WO 2008/036127 (A2) describe oligómeros de morfolino que contienen enlaces entre las subunidades tanto sin carga como catiónicos. Los oligómeros son análogos de oligonucleótidos que contienen secuencias predeterminadas de restos para emparejamiento de bases. La presencia de los enlaces catiónicos entre las subunidades en los oligómeros, normalmente a un nivel de aproximadamente 10 a 50% de la totalidad de los enlaces, se señala que proporciona aumento de la actividad complementaria con relación a los oligómeros sin carga correspondientes. El documento WO 2008/036127 describe además... [Seguir leyendo]

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1. Un compuesto de morfolino que tiene la estructura siguiente

** (Ver fórmula) **

en donde:

R1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo inferior, di (alquil inferior) amino y fenilo;

R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo inferior, arilmetilo monocíclico y (ariloxi) metil monocíclico;

R3 se selecciona del grupo que consiste en triarilmetilo e hidrógeno; e Y se selecciona del grupo que consiste en: un grupo hidroxilo o amino protegido o no protegido; un grupo clorofosforamidato; y un enlace fosforodiamidato al nitrógeno del anillo de morfolino de otro compuesto de morfolino, 10 un enlace fosforodiamidato al nitrógeno del anillo de morfolino de una subunidad de morfolino en un oligómero de morfolino o un soporte sólido;

en donde la expresión alquilo inferior define un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono;

con tal que el compuesto no tenga la siguiente estructura:

** (Ver fórmula) **

en donde: Y es -OH,

** (Ver fórmula) **

en donde X es Cl, el nitrógeno del anillo de otro compuesto de morfolino, el nitrógeno del anillo de morfolino de una subunidad de morfolino en un oligómero de morfolino o un soporte sólido; y

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Tr es tritilo.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Y se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo hidroxilo protegido o no protegido y un grupo clorofosforamidato.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Y es un grupo hidroxilo protegido con trialquilsililo.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Y es un grupo clorofosforamidato de la forma -OP (=O) -N (CH3) 2Cl.

5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R3 se selecciona de tritilo, 4-metoxitritilo, 4-metiltritilo, 4, 4'dimetiltritilo y 4, 4', 4"-trimetiltritilo.

6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R1 es un alquilo inferior, en donde la expresión alquilo inferior define un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono.

7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde R1 es -C (CH) 3.

8. El compuesto de la reivindicación 1, en la que R2 es bencilo o -CH (CH3) 2.

9. Un método de síntesis de un oligómero de morfolino, que comprende:

(a) hacer reaccionar una subunidad de morfolino sobre soporte en fase sólida, que tiene un nitrógeno del anillo sin protección, con un primer monómero de la subunidad de morfolino que tiene un nitrógeno del anillo protegido con triarilmetilo y un grupo fosforamidato activado en un carbono 5' exocíclico, formando de este modo un enlace fosforodiamidato entre dicho carbono 5' exocíclico y dicho nitrógeno del anillo sin protección;

(b) desproteger dicho nitrógeno del anillo protegido, para formar un producto que comprende nitrógeno del anillo sin protección;

(c) opcionalmente hacer reaccionar el producto de la etapa (b) con otro monómero de la subunidad de morfolino que comprende un nitrógeno del anillo de morfolino protegido con triarilmetilo y un grupo de fosforamidato activado en un carbono 5' exocíclico, formando de este modo un enlace fosforodiamidato entre el carbono 5' exocíclico del otro monómero de la subunidad de morfolino y el nitrógeno del anillo de morfolino desprotegido del producto de la etapa (b) ; y

(d) opcionalmente repetir las etapas (b) y (c) una o más veces;

en donde al menos uno de dicho monómero de la subunidad de morfolino, el otro monómero de la subunidad de morfolino o el monómero de la subunidad de morfolino sobre soporte en fase sólida es un compuesto morfolino guanina con doble protección que tiene la estructura:

** (Ver fórmula) **

en donde R1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo inferior, di (alquilo inferior) amino y fenilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo inferior, arilmetilo monocíclico y (ariloxi) metilo monocíclico; R3 se selecciona del grupo que consiste en triarilmetilo y de hidrógeno; e Y es un grupo clorofosforamidato o un soporte sólido;

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en donde la expresión alquilo inferior define un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono, con tal que el compuesto guanina morfolino con doble protección no tenga la estructura siguiente:

** (Ver fórmula) **

en donde Y es un soporte sólido y Tr es tritilo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde Y es un grupo clorofosforamidato de fórmula -OP (=O) -N (CH3) 2Cl, o en donde R3 se selecciona de tritilo (trifenilmetilo) , 4-metoxitritilo, 4-metiltritilo, 4, 4'-dimetiltritilo y 4, 4', 4"-trimetiltritilo, o en donde R1 es alquilo inferior o en donde R2 es bencilo o -CH (CH3) 2, en donde la expresión alquilo inferior define un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono.

11. El método de la reivindicación 9, en donde R1 es -C (CH3) 3.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde dicha desprotección de la etapa (b) comprende exponer dicho nitrógeno del anillo protegido con triarilmetilo a una solución de reactivo que comprende una sal de amina heterocíclica en un disolvente que contiene trifluoroetanol, siendo dicha sal una sal de una amina heterocíclica, que

tiene un pKa comprendido en el intervalo de 1-4 en su forma protonada, con un ácido seleccionado de entre un ácido sulfónico, ácido trifluoroacético y ácido clorhídrico.

13. Un método de síntesis de un oligómero de morfolino, que comprende:

(a) hacer reaccionar una subunidad de morfolino sobre soporte en fase sólida, que tiene un nitrógeno del anillo sin protección, con un primer monómero de la subunidad de morfolino, que tiene un nitrógeno del anillo protegido con triarilmetilo y un grupo fosforamidato activado en un carbono 5' exocíclico, formando de este modo un enlace fosforodiamidato entre dicho carbono 5' exocíclico y dicho nitrógeno del anillo sin protección;

(b) desproteger dicho nitrógeno del anillo protegido, para formar un producto que comprende nitrógeno del anillo sin protección;

(c) opcionalmente hacer reaccionar el producto de la etapa (b) con otro monómero de la subunidad de morfolino que

comprende un nitrógeno del anillo de morfolino protegido con triarilmetilo y un grupo fosforamidato activado en un carbono 5' exocíclico, formando de este modo un enlace fosforodiamidato entre el carbono 5' exocíclico del otro

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monómero de la subunidad de morfolino y el nitrógeno del anillo de morfolino desprotegido del producto de la etapa (b) ;

(d) repetir las etapas (b) y (c) una o más veces con otros monómeros de subunidades de morfolino protegidas con bases;

en donde dicha desprotección comprende exponer dicho nitrógeno del anillo protegido con triarilmetilo a una solución de reactivo que comprende una sal de amina heterocíclica en un disolvente que contiene trifluoroetanol, siendo la sal una sal de una amina heterocíclica, que tiene un pKa comprendido en el intervalo de 1-4 en su forma protonada, con un ácido seleccionado de un ácido sulfónico, ácido trifluoroacético y ácido clorhídrico, y en donde la sal de amina heterocíclica no es trifluoroacetato de 4-cianopiridinio (CYFTA) .

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha amina heterocíclica se selecciona entre el grupo consistente en piridina, tiazol, piridazina, pirazol, triazol sustituidos en el grupo de extracción de electrones.

15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha amina heterocíclica es una piridina sustituida en el grupo de extracción de electrones, en donde dicho grupo de extracción de electrones se selecciona entre el grupo consistente en halógeno, ciano, aldehído, ceto, carboxiéster y carboxamida.

16. El método de la reivindicación 13, en donde dicha sal es una sal de ácido sulfónico, seleccionada de entre un alquilsulfonato, (fluoroalquil) sulfonato, p-toluensulfonato o un trifluoroacetato.

17. El método de la reivindicación 12 o 15, en donde dicha sal es metansulfonato de 3-cloropiridinio (MCP) .

18. El método de la reivindicación 12 o 15, en donde dicho disolvente comprende diclorometano y trifluoroetanol en una proporción en volumen comprendida en el intervalo de aproximadamente 90:10 a 25:75.

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha proporción en volumen es aproximadamente 80:20.

20. El método de la reivindicación 13, en donde dicho triarilmetilo se selecciona del grupo que consiste en tritilo, 4-metoxitritilo, 4-metiltritilo, 4, 4 '-dimetiltritilo y 4, 4', 4"-trimetiltritilo.