Método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes.

La presente invención se relaciona con un método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes,

que comprende los pasos de inocular filamentos de cianobacteria en medio de cultivo MLA complementado con arginina, metionina y ácido alantoico; cultivar la cianobacteria; recolectar un volumen de medio de cultivo y reponer el volumen retirado con medio de cultivo fresco; mantener el cultivoen modo continuo; centrifugar el medio con las cianobacterias.

Método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes.

CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Esta invención se relaciona con un método de producción de cianobacterias (algas verdes-azules fotosintéticas), específicamente al desarrollo de un proceso artificial, masivo, en condiciones controladas, útil para generar metabolitos de interés, tales como toxinas paralizantes, a nivel industrial. El método está caracterizado por su eficiencia, alto rendimiento, simpleza y alta rentabilidad.

DESCRIPCIÓN DEL ARTE PREVIO

Neosaxitoxina y Saxitoxina son componentes del denominado veneno paralizante, estas toxinas son producidas por dinoflagelados de los géneros Alexandrium sp., Piridinium sp., y Gimnodinium sp. y por ende, también a veces se encuentran en los mariscos bivalvos filtradores y gastrópodos carnívoros contaminados por florecimientos algales nocivos, conocidos comúnmente como mareas rojas, (Lagos, N. (1998)) Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386). Estas ficotoxinas, además de ser producidas por dinoflagelados en el mar, también son producidas por cianobacterias en agua dulce (algas verdes-azules fotosintéticas).

Existen publicadas en la literatura, sólo 5 especies de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes de mariscos, cada una de ellas con composición característica tanto en cantidad como tipo de ficotoxinas producidas (perfil de ficotoxinas paralizantes):

- Cylindrospermopsis raciborskii aislada de Brasil (Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil.; TOXICON, 37: 1359 - 1373; Molica, R., Onodera, H., García, C., Rivas, M., Andrinolo, D., Nascimento, S., Meguro, H., Oshima, Y., Azevedo, S., and Lagos, N. ,22, Toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Tabocas reservoir in Caruaru, Pernambuco, Brazil, Phycologia, 41 (6): 66-611).

- Aphanizomenon flos-aquae aislada en Portugal (Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araujo, F., Lagos, N., and Oshima, Y; 2, paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos- aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon, 38: 1689-172.

- Anabaena circinalis aislada de Australia (Lagos, 1999)

- Lyngbya wollei aislada en Norte América (Lagos, 1999)

- Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, (Pereira P LMECYA4). Esta alga verde-azul unicelular fotosintética, es la única cianobacteria de este tipo, productora solamente de las tetrahidropurinas: neosaxitoxina y saxitoxina, en una relación de 78 a 82% de neosaxitoxina y 22 a 18% de saxitoxina.

El método propuesto en la presente solicitud, es el cultivo continuo y bajo condiciones controladas de una cianobacteria que produce un perfil simple de ficotoxinas paralizantes. Este perfil depende de la especie cultivada, e incluye a neosaxitoxina y saxitoxina o Gonyaulatoxinas 2 y 3. Además, este método de cultivo, incluye aditamentos de micro nutrientes, permitiendo la producción más alta de estos compuestos farmacológicamente activos por peso húmedo de microalga hasta ahora descrita.

Neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, son compuestos que presentan una estructura básica que corresponde a las tetrahidropurinas y son producidos por las cianobacterias mencionadas como metabolitos secundarios. Estos compuestos, como todo metabolitos secundario, se encuentran dentro de las células pero también son liberadas al medio de cultivo. Así, se generan dos fuentes de estos productos: en la fracción de la pella celular y en el medio donde se cultivan las cianobacterias.

El cultivo masivo y continuo de estas cianobacterias, tanto en reactores de iluminación abierta o natural, como en reactores de iluminación cerrada, donde la luz se provee por medios artificiales, como por ejemplo tubos fluorescentes u otro, incluidos led de luz blanca, permite la producción permanente y continua de la cianobacteria, la cual es estrictamente necesaria para la posterior producción a nivel industrial de neosaxitoxina, principal componente a purificar a partir de esta cianobacteria. Sin embargo, dependiendo de la cianobacteria cultivada y de las condiciones del cultivo, se pueden purificar posteriormente no sólo neosaxitoxina, sino también saxitoxina y otros

análogos de saxitoxina, como gonyaulatoxinas y otros. Todos estos compuestos pertenecen al grupo de las denominadas flcotoxlnas paralizantes.

El proceso de producción Industrial y continua con alto rendimiento de cianobacterias, no se ha realizado anteriormente. Hasta ahora no se ha descrito el desarrollo de un procedimiento artificial, para una especie de 5 cianobacteria que tiene un perfil de ficotoxina característico y único; por ejemplo, una composición única con sólo neosaxitoxina y saxitoxina en una proporción definida de 5 a 1 respectivamente o solamente de gonyaulatoxinas en ausencia de otras ficotoxinas paralizantes.

Otra característica ventajosa, es la altísima producción de ficotoxinas en las condiciones y procedimientos de cultivo seleccionadas, y que se describen en la presente invención, lo que permite definir a las cianobacterias como la 1 mejor fuente de estas ficotoxinas, especialmente neosaxitoxina para el caso de Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, el componente mayoritario y el de mayor interés para producir masivamente.

Esta especie de cianobacteria Aphar>izomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, es productora de saxitoxina y mayoritariamente neosaxitoxina, y fue colectada en el Lago Crato, un reservorio de aguas en Portugal, aislada y codificada como LMECYA 41 y fue identificada como Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, primero en 15 función de su morfología y posteriormente de acuerdo a su secuencia génica del 16S rRNA (Paulo Pereira, et al., 21. 5th Internacional conference on toxic cianobacteria, 15-2 Julio 21, Queensland, Australia).

Inicialmente esta cepa fue recolectada en una muestra de agua cruda del reservorio, que presentaba una dominancia alta de filamentos de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, siendo esta la segunda especie dominante, encontrándose en un rango de 32 a 4 % de la masa de la especies encontradas en la muestra original. 2 Posteriormente, en el laboratorio, usando técnicas convencionales y de rutina y por repetitivos y sucesivos lavados y aislados de los tricomas, aislados individualmente y sucesivamente en pequeñas gotas de clonación, tomadas con pinzas (pequeños anillos estériles de aislamiento), todos en medio de cultivo estériles y observados en microscopio invertido, se logra obtener un solo tricoma el cual se transfiere a un frasco estéril de un volumen total de 1 mililitros conteniendo 5 mililitros de medio. El cultivo de esta cianobacteria única (unialgal), creció a 25° C entre dos a cuatro 25 semanas, hasta lograr el desarrollo adecuado para la producción posterior. De este desarrollo original se comienza la expansión y producción masiva de esta cianobacteria unialgal, haciendo replicaciones continuas del cultivo según necesidad, guiándose siempre y de acuerdo al recuento de filamentos mantenidos, siempre, en fase exponencial de crecimiento. Durante esta etapa de crecimiento y de desarrollo del cultivo unialgal, se mantiene la cepa en ciclos de luz-oscuridad de 16:8 horas. Los filamentos son contados usando tinción de lugol en cámaras de conteo tipo sedge- 3 wich-raftery Palmer-Maloney, controlando así el desarrollo del cultivo.

Este método de aislar una cianobacteria y obtener un cultivo puro, se puede aplicar a cualquiera de las otras cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes anteriormente mencionadas.

Una vez obtenido el cultivo puro, se utiliza como inoculo para la producción masiva de cianobacterias de acuerdo al presente invento.

Las ventajas de la presente invención, a través de producción masiva y en condiciones controladas de cianobacteria productora de ficotoxinas paralizantes, son:

Una producción continua, permanente y en condiciones controladas de cianobacteria productora de ficotoxinas paralizantes

Bajo costo productivo porque el medio de cultivo es muy elemental, sin nutrientes de alto valor y sólo requiere 4 control de luz, lo cual significa un fácil manejo de la cianobacteria,

Proveer una fuente continua, independiente de las condiciones y cambios de medios ambientes, de ficotoxinas paralizantes (saxitoxina , neosaxitoxina y gonyaulatoxinas)

Relación costo-producción-rendimiento muy favorable, no logrado hasta ahora y tampoco descritos en proceso... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes seleccionadas del grupo que consiste en Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon(Aph) issatschenkoi (Usacev) Proskina-Lavrenco, Anabaena circinalis, Lyngbya wollei y Aphanizomenon gracile (Lemm) Lemm., CARACTERIZADO porque dicho método comprende los pasos de:

a. inocular entre 2 y 4 millones de filamentos de cianobacteria por cada 3 litros de medio de cultivo MLA que comprende MgS4-7H2, NaN3, K2HPO4, H3BO3, H2Se4, biotina, vitamina B12, tiamina HCI, CuS4-5H2, ZnS4-7H2, CoCI2-6H2, NaMoO4-2H2, Na2EDTA, FeCI3-6H2, NaHC3, MnCI2H2 complementado con entre 2 y 3,5 mM de arginina, entre 1 y 2,2 mM de metionina y entre ,7 y 1,3 mM de ácido alantoico;

b. cultivar la cianobacteria en el medio de cultivo a una temperatura de entre 15 y 35°C, con luz permanente natural o artificial;

c. recolectar un volumen de medio de cultivo de entre un 2 a un 4% del volumen total cada 1 a 3 días y reponer el volumen retirado con medio de cultivo fresco;

d. mantener el cultivo en modo continuo;

e. centrifugar el medio con las cianobacterias recolectado en c) entre un rango de 5. a 15. x g por un período

de tiempo de entre 5 y 3 minutos y obtener dicha cianobacteria del pellet resultante de la centrifugación.

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en el que la temperatura de cultivo se encuentra en un rango de 15 y

25°C.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 2, en el que dicha temperatura es 22±2°C.

4. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo tiene una concentración de arginina final de

2,8 mM.

5. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo tiene una concentración de metionina final

de 1,7 mM.

6. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo tiene una concentración de ácido alantoico final de 1, mM.