Método de imagenología y uso del mismo.

Método para determinar y cuantificar los elementos topográficos de superficies biológicas usando los datos recibidos por microscopía de fuerza atómica,

que comprende las etapas de

a. Preparar, in vitro, una sola célula, monocapa celular o sección de tejido;

b. Predefinir una máscara en el plano xy para estructuras subcelulares de dicha célula única, monocapa celular o sección de tejido;

c. Determinar el volumen de desviación local (LDV) de dichas estructuras subcelulares en dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde el volumen de desviación local se define como una excursión a nanoescala en la dirección z sobre dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde se evalúa el volumen local protuberante, positivo o deprimido, negativo, en comparación con el nivel promedio de la superficie de dicha máscara predefinida;

d. Normalizar el volumen positivo o negativo dentro del área de dicha máscara predefinida;

e. Cuantificar el volumen de desviación local;

f. Analizar los datos comparándolos con los elementos topográficos característicos de una muestra calibrada;

g. Evaluar los elementos estructurales cuantificados para obtener los conjuntos de parámetros.

Método de imagenología y uso del mismo Campo de la invención La presente invención se relaciona con un método basado en la microscopía de fuerza atómica y el uso del mismo en superficies biológicas.

Antecedentes de la invención Se conocen muchos métodos de imagenología para los propósitos de diagnóstico, que incluyen el uso de radioisótopos o imágenes de rayos x. Además de estos métodos, la imagenología diagnóstica se realiza en biopsias de tejidos o líquidos del cuerpo vivo para determinar la existencia o la causa de una enfermedad. En la última década se han desarrollado sistemas de formación de imágenes usando cultivos celulares de células tomadas de un paciente, con el fin de detectar marcadores que se correlacionan con las enfermedades. Estos sistemas se basan principalmente en el acoplamiento de las muestras biológicas a epítopos definidos en los que las muestras biológicas se marcan con un colorante, preferentemente un colorante fluorescente.

Las pruebas farmacológicas y los ensayos de selección de bajo rendimiento se basan también cada vez más en el cultivo de células de mamíferos (selección de alto contenido, HCS) . En comparación con las pruebas de afinidad bioquímicas usadas en la selección de alto rendimiento molecular (HTS) , estos bioensayos HCS ofrecen la unidad viva más pequeña para la detección de efectos adversos en un nivel menor de daño. Por lo tanto, estos pueden ayudar a evitar el estrés de los animales con compuestos farmacéuticos de plomo. Usualmente, también en ensayos basados en células, la lectura es un producto bioquímico como en chips de ADN, ARN y proteínas o inmunocitoquímica o algunas veces en experimentos electrofisiológicos.

La microscopía de fuerza atómica (AFM) se inventó hace dos décadas y se ha convertido en una herramienta versátil para los estudios biológicos en biomoléculas sencillas, agregados, virus, células o tejidos. El método salva la brecha entre la técnica de microscopía electrónica (EM) con resolución en nm y la microscopía óptica (OM) en escala de μm. Como tal, combina las ventajas de alta resolución y la capacidad de investigar células bajo condiciones fisiológicas tamponadas. Al mismo tiempo, no se necesitan las etapas desventajosas de secado o recubrimiento de la muestra para EM o el marcaje con cromóforo como en la microscopía de fluorescencia (FM) . Adicionalmente, pueden obtenerse propiedades mecánicas locales de la muestra (Riethmuller C., Schaffer T.E., Kienberger F., Stracke W. y Oberleithner H.; 2007; Ultramicroscopy 107:895-901; Rotsch C. y Radmacher M.; 2000; Biophys. J. 78:520-535) . Por lo tanto, la investigación de una muestra biológica muy cercana a las condiciones fisiológicas es posible sólo con un mínimo de artefactos derivados del procedimiento.

El registro de la topografía de la muestra biológica, incluidas las superficies celulares -vivas o fijadas -ha sido la base de los estudios de AFM biológicamente inspirados desde entonces (Braet F., de Zanger R. y Wisse E.; 1997; J. Microsc. 186 (Pt 1) :84-87.; Oberleithner H., Giebisch G. y Geibel, J.; 1993; Pflugers Arch. 425:506-510; Chang L., y otros; 1993; BiophysJ. 64:1282-1286) .

La US 6, 357, 285 B1 describe un método para investigar la topografía de un objetivo biológico entero mediante la descripción de nuevos métodos de representación de los datos obtenidos por mediciones de AFM convencionales. Técnicamente hablando, los perfiles bidimensionales de la altura (o secciones transversales) -como los proporcionados por el programa informático del instrumento de AFM -se usan sin procesamiento adicional de los datos para un fenotipado. Después de eso, el volumen del objeto entero se calcula con la ayuda del programa informático del instrumento suministrado por el fabricante. Más específicamente, el volumen del objeto entero se obtiene al sumar todas las representaciones numéricas (valores de altura) con respecto al plano X-Y de fondo para generar el volumen. Las diferencias de altura se refieren al mínimo global de la imagen entera.

Sin embargo, aún son difíciles de identificar estructuras definidas, especialmente sobre células completas, donde sólo las estructuras del citoesqueleto se reconocen de manera obvia. Ellas se componen casi exclusivamente de actina fibrilar; las contribuciones de los microtúbulos pueden despreciarse. Sin embargo, dado que las características morfológicas son difíciles de clasificar, es difícil realizar una cuantificación reproducible. Por lo tanto, la mayoría de los estudios usan un enfoque cualitativo, más que descriptivo, de manera que frecuentemente se desea una superposición de AFM y un marcador de fluorescencia para demostrar la estructura reivindicada.

Sin embargo, la identificación de fluorescencia se ve obstaculizada por la perturbación mutua de los protocolos de fijación

para AFM y FM. Las características estructurales aceptadas de manera inequívoca son las fibras de estrés de actina (Haga H., Sasaki S., Kawabata K., Ito E., Ushiki T. y Sambongi T.; 2000; Ultramicroscopy 82:253-258) , microvellosidades (Poole K., Meder D., Simons K. y Muller D.; 2004; FEBS Lett. 565:53-58) y uniones celulares (Riethmuller C., Oberleithner H., Wilhelmi M., Franz J., Schlatter E., Klokkers J. y Edemir B.; 2008; Biophys. J. 94:671-678) . Recientemente, los organelos intracelulares también podrían ser identificados a través de sus mecánicos específicos (Riethmuller C., Schaffer T.E., Kienberger F., Stracke W. y Oberleithner H.; 2007; Ultramicroscopy 107:895-901) . Más allá de eso, sólo las configuraciones muy delicadas pueden ofrecer una información más detallada; en modelos de células especiales, donde un tipo de receptor se expresa abundantemente, algunos agregados se pueden explorar sin marcador (Hoogenboom, B.W., Suda K., Engel A. y Fotiadis D.; 2007; J. Mol. Biol. 370:246-255) o con el procedimiento de TREC, donde la topografía puede registrarse simultáneamente con la localización de un objetivo específico con el uso de puntas modificadas con anticuerpos (Kienberger F., Ebner A., Gruber H.J. y Hinterdorfer P.; 2006; Acc. Chem. Res. 39:29-36) .

Resumen de la invención Partiendo de este estado de la técnica, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para determinar y cuantificar los elementos topográficos de superficies biológicas.

La invención proporciona un método para determinar y cuantificar los elementos topográficos de superficies biológicas usando los datos recibidos por microscopía de fuerza atómica, que comprende las etapas de

a. Preparar, in vitro, una sola célula, una monocapa celular o una sección de tejido;

b. Predefinir una máscara en el plano xy para estructuras subcelulares de dicha célula única, monocapa celular o sección de tejido;

c. Determinar el volumen de desviación local (LDV) de dichas estructuras subcelulares en dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde el volumen de desviación local se define como una excursión a nanoescala en la dirección z sobre dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde se evalúa el volumen local protuberante, positivo o deprimido, negativo, en comparación con el nivel promedio de la superficie de dicha máscara predefinida;

d. Normalizar el volumen positivo o negativo dentro del área de dicha máscara predefinida;

e. Cuantificar el volumen de desviación local;

f. Analizar los datos comparándolos con los elementos topográficos característicos de una muestra calibrada;

g. Evaluar los elementos estructurales cuantificados para obtener los conjuntos de parámetros.

Se pretende que el área analizada sea menor que la superficie de una célula, en donde la célula es preferentemente una célula eucariota analizada, con mayor preferencia una célula de mamífero. El uso de áreas de superposición para el análisis hace posible obtener la información general sobre un área más grande mediante el montaje de estas.

Los conjuntos de parámetros que se producen con el método de la invención pueden usarse para producir una imagen. Además, se pretende que la imagen que muestra los volúmenes de desviación pueda combinarse con imágenes obtenidas con el uso de fluorescencia por ejemplo, u otro marcador visible ópticamente.

Para la evaluación de los datos obtenidos durante la determinación del LDV puede usarse una red neuronal, en donde la red neuronal comprende preferentemente al menos tres capas. Para la persona experta en la técnica es obvio que cualquier otro algoritmo conocido es aplicable para la evaluación de los datos, incluso en la etapa de analizar los datos.

La determinación del LDV tiene lugar en una parte predefinida de la superficie celular, en donde la parte subdividida de la célula o de la superficie... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar y cuantificar los elementos topográficos de superficies biológicas usando los datos recibidos por microscopía de fuerza atómica, que comprende las etapas de

a. Preparar, in vitro, una sola célula, monocapa celular o sección de tejido;

b. Predefinir una máscara en el plano xy para estructuras subcelulares de dicha célula única, monocapa celular o sección de tejido;

c. Determinar el volumen de desviación local (LDV) de dichas estructuras subcelulares en dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde el volumen de desviación local se define como una excursión a nanoescala en la dirección z sobre dicha máscara predefinida en el plano xy, en donde se evalúa el volumen local protuberante, positivo o deprimido, negativo, en comparación con el nivel promedio de la superficie de dicha máscara predefinida;

d. Normalizar el volumen positivo o negativo dentro del área de dicha máscara predefinida;

e. Cuantificar el volumen de desviación local;

f. Analizar los datos comparándolos con los elementos topográficos característicos de una muestra calibrada;

g. Evaluar los elementos estructurales cuantificados para obtener los conjuntos de parámetros.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el área analizada es menos que la superficie de una célula, en donde la célula es preferentemente una célula eucariota analizada, con mayor preferencia una célula de mamífero.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde las áreas de superficie celular se superponen para agruparlas en un área más grande.

4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 3, en donde se usa una red neuronal para la evaluación de los datos, en donde la red neural comprende al menos tres capas.

5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 4, en donde la parte subdividida de la célula comprende una longitud de preferentemente 2 a 20 μm.

6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 5, en donde la parte subdividida de la célula comprende un volumen de desviación en el intervalo de 0.2 a 20 μm en los ejes xy y <500 nm en el eje z.

7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra calibrada comprende datos de un marcador de la superficie celular, de estructuras topográficas o morfológicas.

8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el marcador de superficie celular, las estructuras topográficas o morfológicas comprenden protuberancias, depresiones u otras estructuras morfológicas o combinaciones de estas o patrones específicos de tales estructuras.

9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los conjuntos de parámetros se usan para producir un mapa de elementos topográficos.

10. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el mapeo in vivo e in vitro y la cuantificación del marcador de superficie celular, las estructuras topográficas o morfológicas sobre superficies celulares

o superficies de uniones celulares.

11. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la detección de marcador de superficie celular específico, de estructuras topográficas o morfológicas relacionadas con enfermedades, en donde las enfermedades se eligen del grupo de enfermedades tumorales, cardiovasculares, nefríticas, fibróticas, inflamatorias, arterioscleróticas o auto-inmunes.

12. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para:

- determinar un marcador de superficie celular como marcador de diagnóstico; o -determinar estructuras topográficas como marcador diagnóstico; o -determinar estructuras morfológicas como marcador diagnóstico; o -determinar fuerzas mecánicas celulares; o -determinar fuerzas contráctiles; o -un sistema de clasificación basado en cultivo celular para el diagnóstico.

13. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para dar seguimiento a los cambios de marcador de superficie celular, las estructuras topográficas o morfológicas en la profilaxis, el diagnóstico, la terapia, el seguimiento y/o cuidados posteriores a una terapia en cualquiera de las enfermedades de la reivindicación 11.

14. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la producción o selección de un fármaco para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades de la reivindicación 11, que comprende composiciones farmacéuticas, anticuerpos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o productos químicos.

15. El uso de un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, en donde la máscara predefinida en el plano xy para la determinación del LDV se determina mediante métodos ópticos, que comprenden microscopía por contraste de fase, fluorescencia o Raman.