Método de determinación de un régimen quimioterápico basado en la expresión de glutatión-S-transferasa Pi.

Método para determinar un régimen quimioterápico para tratar un tumor en un paciente,

que comprende:

(a) desparafinar una muestra de tumor fijada embebida en parafina para obtener una muestra de tumor desparafinada;

(b) aislar ARNm de la muestra de tumor desparafinada en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico mediante calentamiento de la muestra de tejido en una disolución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a 100ºC durante un periodo de tiempo de 5 a 120 minutos y recuperar el ARNm de la disolución caotrópica, en el que el tumor es un adenocarcinoma esofagocardiaco o cáncer de pulmón de células no pequeñas;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores de oligonucleótido que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con una región del gen GST-pi, para obtener una muestra amplificada;

(d) determinar la cantidad de ARNm de GST-pi en la muestra amplificada;

(e) comparar la cantidad de ARNm de GST-pi de la etapa (d) con una cantidad de ARNm de un gen de control interno; y

(f) elegir un régimen quimioterápico basado en platino como el régimen quimioterápico basado en la cantidad de ARNm de GST-pi en la muestra amplificada y un nivel umbral predeterminado para la expresión del gen GST-pi.

Método de determinación de un régimen quimioterápico basado en la expresión de glutatión-S-transferasa Pi

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de pronóstico que son útiles en medicina, particularmente en quimioterapia contra el cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de la expresión génica de células tumorales en un paciente. La resistencia de las células tumorales a agentes quimioterápicos que tienen como diana el ADN, especialmente agentes que dañan el ADN de la manera de agentes de platinación, se somete a ensayo examinando el ARNm expresado a partir de genes implicados en la reparación del ADN en seres humanos.

Antecedentes de la invención Se produce cáncer cuando una célula normal experimenta transformación neoplásica y se convierte en una célula maligna. Las células transformadas (malignas) escapan a los controles fisiológicos normales que especifican el fenotipo celular y que restringen la proliferación celular. Las células transformadas en el cuerpo de un individuo por tanto proliferan, formando un tumor. Cuando se encuentra un tumor, el objetivo clínico es destruir las células malignas selectivamente mientras se mitiga cualquier daño causado a células normales en el individuo que se somete a tratamiento.

La quimioterapia se basa en el uso de fármacos que son selectivamente tóxicos (citotóxicos) para las células cancerígenas. Se han desarrollado varias clases generales de fármacos quimioterápicos, incluyendo fármacos que interfieren con la síntesis de ácidos nucleicos, síntesis de proteínas y otros procesos metabólicos vitales. Estos se denominan en general fármacos antimetabolitos. Otras clases de fármacos quimioterápicos infligen daño en el ADN celular. Los fármacos de estas clases se denominan en general genotóxicos. Sin embargo, la sensibilidad de un neoplasma individual a un fármaco quimioterápico deseado o combinación de fármacos a menudo puede evaluarse de manera precisa sólo tras un periodo de ensayo de tratamiento. El tiempo invertido en un periodo de ensayo insatisfactorio plantea un riesgo significativo en el tratamiento clínico de tumores malignos agresivos.

La reparación de daño al ADN celular es un proceso biológico importante llevado a cabo por la maquinaria de reparación de ADN enzimática de una célula. Las lesiones no reparadas en el genoma de una célula pueden impedir la replicación del ADN, afectar a la fidelidad de replicación del ADN recién sintetizado y/o dificultar la expresión de genes necesarios para la supervivencia celular. Por tanto, los fármacos genotóxicos se consideran en general más tóxicos para células que se dividen activamente que participan en la síntesis de ADN que para células quiescentes, de no se dividen. Las células normales de muchos tejidos corporales son quiescentes y con poca frecuencia vuelven a entrar en el ciclo celular y dividirse. Se permite en general mayor tiempo entre rondas de división celular para la reparación del daño al ADN en células normales infligido por genotoxinas quimioterápicas. Como resultado, se consigue alguna selectividad para la destrucción de células cancerígenas. Muchos regímenes de tratamiento reflejan intentos de mejora de la selectividad para células cancerígenas mediante la coadministración de fármacos quimioterápicos pertenecientes a dos o más de estas clases generales.

Debido a que la quimioterapia eficaz en tumores sólidos habitualmente requiere una combinación de agentes, la identificación y cuantificación de determinantes de resistencia o sensibilidad a cada fármaco individual se ha 45 convertido en una herramienta importante para diseñar una quimioterapia de combinación individual.

Dos fármacos anticancerígenos genotóxicos ampliamente usados que se han mostrado que dañan el ADN celular son cisplatino (DDP) y carboplatino. El cisplatino y/o el carboplatino se usan actualmente en el tratamiento de distintos neoplasmas seleccionados de origen epitelial y mesenquimatoso, incluyendo carcinomas y sarcomas de los tractos respiratorio, gastrointestinal y reproductor, del sistema nervioso central y de origen escamoso en la cabeza y el cuello. Se prefiere actualmente el cisplatino en combinación con otros agentes para el tratamiento del carcinoma testicular, y en muchos casos produce una remisión duradera. (Loehrer et al., 1984, 100 Ann. Int. Med. 704) . El cisplatino (DDP) altera la estructura del ADN a través de la formación de aductos intracatenarios. La resistencia a agentes de platino tales como DDP se ha atribuido a tolerancia aumentada a aductos de platino, acumulación de 55 fármaco disminuida o reparación de ADN aumentada. Aunque la resistencia a DDP es multifactorial, las alteraciones en los mecanismos de reparación del ADN probablemente desempeñan un papel significativo.

La familia de proteínas de glutatión-S-transferasa (GST) está implicada en la detoxificación de fármacos citotóxicos. Catalizando la conjugación de moléculas electrófilas carcinogénicas y tóxicas con glutatión, las enzimas GST protegen las macromoléculas celulares de daño (Boyer et al., Preparation, characterization and properties of glutathione S-transferases. En: Zakim D, Vessey D (eds.) Biochemical Pharmacology and Toxicology. Nueva York, NY: John Wiley and Sons, 1985.) . Un tipo isomérico determinado de estas proteínas, la glutatión S-transferasa Pi (GST-pi, denominándose también de manera intercambiable GSTP1 o GST-π en el presente documento) se expresa ampliamente en tejidos epiteliales humanos y se ha demostrado que se sobreexpresa en varios tumores (Terrier et 65 al., Am J Pathol 1990; 137: 845-853; Moscow et al., Cancer Res 1989; 49: 1422-1428, Fan et al., Anticancer Research, Vol. 20, 2000, págs. 4809-4814) . Se han encontrado niveles aumentados de GST-pi en tumores resistentes a fármacos, aunque el mecanismo exacto sigue sin aclararse (Tsuchida et al., Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27: 337-384) . Estudios previos han sugerido que la baja expresión de la proteína GST (no del ARNm) se asocia con respuesta a quimioterapia basada en platino (Nishimura et al., Cancer. Clin Cancer Res 1996; 2:18591865; Tominaga, et al., Am. J. Gastro. 94:1664-1668, 1999; Kase, et al., Acta Cytologia. 42: 1397-1402, 1998) . Sin embargo, estos estudios no medían la expresión génica cuantitativa, sino que usaban un método de tinción inmunohistoquímica semicuantitativa para medir niveles de proteína. Sin embargo, se necesitan mediciones de expresión cuantitativa del gen GST-pi para conseguir un pronóstico muy eficaz.

La mayoría de muestras patológicas se fijan y se embeben en parafina (FPE) de manera rutinaria para permitir el análisis histológico y el posterior almacenamiento de archivo. Por tanto, la mayoría de muestras de tejido de biopsia no son útiles para el análisis de la expresión génica porque tales estudios requieren una alta integridad de ARN de manera que pueda obtenerse una medida precisa de la expresión génica. Actualmente, los niveles de expresión génica sólo pueden monitorizarse cualitativamente en tales muestras fijadas y embebidas usando tinción inmunohistoquímica para monitorizar niveles de expresión de proteínas.

Hasta ahora, estudios de expresión génica cuantitativa incluyendo los de la expresión de GST-pi se han limitado a amplificación por reacción en cadena de la polimerasa - transcriptasa inversa (RT-PCR) de ARN de tejido fresco o congelado.

El uso de tejido congelado por profesionales sanitarios plantea inconvenientes sustanciales. El envío rápido de la biopsia para evitar la degradación del tejido y posteriormente la del ARNm es la principal preocupación cuando se planea cualquier ensayo de marcador genético cuantitativo basado en ARN. Los profesionales sanitarios que realizan la biopsia, deben enviar la muestra de tejido rápidamente a una instalación equipada para llevar a cabo un protocolo de extracción de ARN inmediatamente en cuanto se recibe la muestra de tejido. Si no está disponible tal

instalación, el médico debe congelar inmediatamente la muestra para impedir la degradación del ARNm. Para que la instalación de diagnóstico lleve a cabo un protocolo de extracción de ARN útil antes de la degradación de tejido y ARN, la muestra de tejido debe permanecer congelada hasta que llegue a la instalación de diagnóstico, a pesar de lo lejos que pueda estar. El mantenimiento de la integridad del tejido congelado durante el transporte usando mensajeros especializados equipados con nitrógeno líquido y hielo seco, conlleva un gran coste.

Las biopsias de rutina comprenden en general una mezcla heterogénea de tejido estromal y tumoral. A diferencia del tejido fresco o congelado, las muestras de tejido de biopsia... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar un régimen quimioterápico para tratar un tumor en un paciente, que comprende:

(a) desparafinar una muestra de tumor fijada embebida en parafina para obtener una muestra de tumor desparafinada;

(b) aislar ARNm de la muestra de tumor desparafinada en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico mediante calentamiento de la muestra de tejido en una disolución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a 100ºC durante un periodo de tiempo de 5 a 120 minutos y recuperar el ARNm de la disolución caotrópica, en el que el tumor es un adenocarcinoma esofagocardiaco

o cáncer de pulmón de células no pequeñas;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores de oligonucleótido que hibridan en condiciones de 15 alta rigurosidad con una región del gen GST-pi, para obtener una muestra amplificada;

(d) determinar la cantidad de ARNm de GST-pi en la muestra amplificada;

(e) comparar la cantidad de ARNm de GST-pi de la etapa (d) con una cantidad de ARNm de un gen de control interno; y

(f) elegir un régimen quimioterápico basado en platino como el régimen quimioterápico basado en la cantidad de ARNm de GST-pi en la muestra amplificada y un nivel umbral predeterminado para la expresión del gen GST-pi.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el par de cebadores de oligonucleótido consiste en un oligonucleótido de SEQ ID NO: 1 o un oligonucleótido con una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma y un oligonucleótido de SEQ ID NO: 2 o un oligonucleótido con una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el par de cebadores de oligonucleótido consiste en un oligonucleótido de SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido de SEQ ID NO: 2.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel umbral de expresión del gen GST-pi es 1, 0 x 10-3 veces el nivel de expresión del gen de control interno.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el régimen quimioterápico basado en platino comprende cisplatino, carboplatino, cis-diamino- (1, 2-ciclohexil) -dicloroplatino (II) o cis- (1, 2-etilendiamina) dicloroplatino (II) .

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el tumor es un tumor de adenocarcinoma esofagocardiaco.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el régimen quimioterápico basado en platino comprende cisplatino.

8. Método para determinar el nivel de expresión de GST-pi en una muestra de tejido embebida en parafina fijada, que comprende:

(a) desparafinar la muestra de tejido; para obtener una muestra desparafinada;

(b) aislar ARNm de la muestra desparafinada en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico mediante calentamiento de la muestra de tejido en una disolución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a 100ºC durante un periodo de tiempo de 5 a 120 minutos y recuperar el ARNm de la disolución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores de oligonucleótido que hibridan en condiciones rigurosas con una región del gen GST-pi, para obtener una muestra amplificada; y

(d) determinar la cantidad de ARNm de GST-pi en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

9. Método según la reivindicación 8 en el que el par de cebadores de oligonucleótido consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma y un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma.

10. Método según la reivindicación 8 en el que, el gen de control interno es β-actina. 65

11. Cebador de oligonucleótido que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia idéntica en al menos

el 80% a la misma.

12. Cebador de oligonucleótido que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia idéntica en al menos

el 80% a la misma. 5

13. Kit para detectar la expresión de un gen GST-pi que comprende un par de cebadores de oligonucleótido que consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma y un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia idéntica en al menos el 80% a la misma.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7, en el que el tumor es un cáncer de pulmón de células no pequeñas.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que el par de cebadores de oligonucleótido 15 consiste en un oligonucleótido de SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido de SEQ ID NO: 2.