Método de detección sistemática mediante adsorción de la muestra en papel de filtro.

Un método para preparar una muestra de sangre u otro líquido biológico para su análisis,

donde dicho método consiste en

(a) iniciar una reacción mediante mezcla de una muestra de sangre u otro líquido biológico con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre u otro líquido biológico para causar una alteración en la composición de la muestra de sangre u otro líquido biológico

(b) detener la reacción sembrando gotas de la mezcla de sangre u otro líquido biológico y el compuesto de prueba en papel de filtro;

donde el compuesto de prueba se elige entre una toxina, un alérgeno, un autoantígeno, una proteína o un polisacárido bacterianos, una proteína viral, una proteína o un polisacárido fúngicos, una proteína o un polisacárido de un parásito o un lipopolisacárido bacteriano.

Mïtodo de detecciïn sistemïtica mediante adsorciïn de la muestra en papel de filtro Campo de la invenciïn La presente invenciïn da a conocer un mïtodo para preparar una muestra de sangre u otro lïquido biolïgico para su anïlisis mediante la mezcla de la muestra de sangre u otro lïquido biolïgico con un compuesto de prueba y la siembra de sangre u otro lïquido biolïgico en un papel de filtro para el anïlisis posterior del efecto de dicho compuesto de prueba sobre la muestra de sangre o lïquido.

Antecedentes generales La sangre es una mezcla compleja compuesta por plasma y cïlulas (1-3) . El plasma se puede separar de las cïlulas por centrifugaciïn y otras tïcnicas. Si el plasma se deja en reposo coagularï y el suero se puede separar del coïgulo de sangre. La coagulaciïn puede ser inhibida por adiciïn de diversos anticoagulantes, por ejemplo EDTA, EGTA, heparina, citrato y otros. Las cïlulas sanguïneas incluyen cïlulas dendrïticas, macrïfagos, monocitos, neutrïfilos, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolïticos naturales, glïbulos rojos y diversos citoblastos como los hemocitoblastos. Ademïs estïn presentes en grandes cantidades plaquetas derivadas de megacariocitos. El plasma contiene miles de proteïnas, en principio cualquier proteïna del proteoma humano (4, 5) . Algunas de las proteïnas estïn involucradas en el transporte, la coagulaciïn de la sangre o la inmunidad, mientras que otras actïan como molïculas de seïalizaciïn entre las cïlulas de la sangre y las cïlulas de los tejidos. En particular, la actividad de las cïlulas del sistema inmunitario (cïlulas dendrïticas, macrïfagos, linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citolïticos naturales) estï regulada por una red compleja de molïculas de seïalizaciïn (por ejemplo interleucinas, quimiocinas,

factores de crecimiento) , antïgenos tisulares y receptores (3, 6-9) . Se pueden investigar y cuantificar la actividad y la especificidad de las cïlulas del sistema inmunitario por varios mïtodos y ensayos. Los linfocitos T, los linfocitos B y otras cïlulas se pueden cuantificar mediante clasificaciïn celular activada por fluorescencia usando anticuerpos contra molïculas marcadoras de la superficie cïlular (10, 11) . Los linfocitos T especïficos se pueden medir mediante ensayos de citotoxicidad, ensayos de liberaciïn de cromo y ensayos de liberaciïn de citocinas (por ej. ELISPOT)

(12-16) y usando diversos constructos proteicos pïptido-complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (17, 18) . La actividad de los linfocitos B se puede medir mediante la determinaciïn de los niveles de anticuerpos especïficos liberados por los linfocitos B (19, 20) .

Un problema importante en la mediciïn de las molïculas de seïalizaciïn liberadas de las cïlulas sanguïneas es el

del almacenamiento y transporte en relaciïn con la cuantificaciïn. Muchos componentes sanguïneos por ej. citocinas) son lïbiles y de vida corta, lo que resulta en una degradaciïn durante la incubaciïn, el almacenamiento y el transporte. Por esta razïn, los anïlisis comparativos y las pruebas diagnïsticas se deben llevar a cabo inmediatamente despuïs de la extracciïn de la sangre y la incubaciïn en los laboratorios centrales. Idealmente, se deben analizar consecutivamente todas las muestras que se van a comparar usando un instrumento calibrado.

Esto no siempre es prïctico, por ej. cuando se extraen muestras de sangre en ïreas alejadas, cuando se hacen estudios en el tiempo in vitro e in vivo o cuando se comparan muestras de muchos individuos diferentes. Una soluciïn a este problema es congelar las muestras para el transporte y el almacenamiento. Esto, no obstante, no garantiza la conservaciïn de los componentes, requiere gran capacidad de congelaciïn, transporte y

almacenamiento, requiere descongelar cada vez que se realiza el anïlisis y es vulnerable con respecto a la falta de suministro de energïa elïctrica. Por esta razïn, existe la necesidad de mïtodos confiables de conservaciïn de las muestras de sangre y biolïgicas, y existe la necesidad de pruebas diagnïsticas que empleen una conservaciïn de la muestra en combinaciïn con la manipulaciïn de la muestra que sea confiable.

El uso de papel de filtro para la siembra de gotas de sangre para el anïlisis posterior es muy conocido, por ejemplo, para el anïlisis de muestras de sangre de reciïn nacidos en busca de enfermedades metabïlicas hereditarias (21) . Las ventajas de esto son la buena conservaciïn de los componentes sanguïneos, el fïcil transporte y el fïcil almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, el uso de papel de filtro y de mïtodos similares para el secado y el almacenamiento de muestras de sangre luego de la incubaciïn con compuestos de prueba no ha sido utilizado ni 55 descrito antes posiblemente porque se preveïa que fuera imposible o impracticable.

Skogstrand et al (22) dan a conocer un mïtodo para preparar una muestra de sangre para el anïlisis que consiste en sembrar gotas de sangre en papel de filtro, permitir que se sequen y posteriormente analizar dichas muestras de sangre seca en busca de marcadores inflamatorios.

Aburuz et al (24) y Koal et al (25) dan a conocer mïtodos para preparar una muestra de sangre en la que la sangre se siembra como gotas en papel de filtro, se seca y posteriormente se analiza.

Resumen de la invenciïn Esta invenciïn da a conocer un mïtodo para preparar una muestra de sangre (u otro lïquido biolïgico) para anïlisis, donde dicho mïtodo consiste en (a) iniciar una reacciïn mediante mezcla de una muestra de sangre (u otro lïquido biolïgico) con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre (u otro lïquido biolïgico) para causar una alteraciïn en la composiciïn de la muestra de sangre (u otro lïquido biolïgico)

(b) detener la reacciïn sembrando gotas de sangre (u otro lïquido biolïgico) en papel de filtro; donde el

compuesto de prueba se elige entre una toxina, un alïrgeno, un autoantïgeno, una proteïna o un polisacïrido bacterianos, una proteïna viral, una proteïna o un polisacïrido fïngicos, una proteïna o un polisacïrido de un parïsito o un lipopolisacïrido bacteriano.

Divulgaciïn detallada de la invenciïn La presente invenciïn da a conocer un mïtodo que consiste en mezclar una muestra de sangre u otro lïquido biolïgico con un compuesto de prueba y sembrar gotas de sangre u otro lïquido biolïgico en papel de filtro para el anïlisis posterior del efecto de dicho compuesto de prueba sobre la muestra de sangre u otro lïquido biolïgico. El lïquido biolïgico puede ser lïquido cefalorraquïdeo, lïquido peritoneal, lïquido quïstico, lïquido amniïtico, lïquido de lavado, saliva, extracto celular o extracto tisular. El compuesto se elige entre un aminoïcido, un pïptido, una proteïna, un carbohidrato, un oligosacïrido, un polisacïrido, una glucoproteïna, un lïpido, una lipoproteïna, un glucosaminoglucano, una hormona, un esteroide, una vitamina, un compuesto sintïtico o natural de bajo peso molecular que afecta a la sangre para causar una alteraciïn de su composiciïn por ejemplo una toxina, un alïrgeno, un autoantïgeno, una proteïna o un polisacïrido bacterianos, una proteïna viral, una proteïna o un polisacïrido fïngicos, una proteïna o un polisacïrido de un parïsito o un lipopolisacïrido bacteriano o cualquier otro compuesto relacionado con las enfermedades.

El mïtodo segïn la invenciïn analiza la muestra para determinar el contenido de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento y/o neurotransmisores y otros polipïptidos y proteïnas por ej. CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, anticuerpos especïficos (por ej, especïficos del antïgeno) , transferrina, albïmina o transtiretina.

El efecto del compuesto de prueba se analiza mediante inmunoensayo, bioensayo, espectrometrïa de masas, HPLC, GC, GC-MS por ejemplo ensayos ELISA, ensayos FLISA, ensayos DELFIA, ensayos Luminex, ensayos de luminiscencia, ensayos de electroquimioluminiscencia, ensayos de proximidad de centelleo, radioinmunoensayos,

MALDI-MS, ESI-MS y MS ambiental (por ej. DESI-MS) .

Tambiïn se da a conocer un mïtodo de mezcla de sangre u otro lïquido biolïgico con un compuesto de prueba y la siembra de gotas de la mezcla en papel de filtro para el almacenamiento, el transporte o la manipulaciïn antes del anïlisis posterior del efecto del compuesto de prueba sobre la sangre, el lïquido biolïgico o la muestra.

Definiciones:

Analito significa cualquier compuesto que se puede detectar o cuantificar por medios analïticos.

Por el efecto del compuesto de prueba se entiende que ïste interacciona con los componentes de la sangre o cualquier... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para preparar una muestra de sangre u otro lïquido biolïgico para su anïlisis, donde dicho mïtodo consiste en 5

(a) iniciar una reacciïn mediante mezcla de una muestra de sangre u otro lïquido biolïgico con un compuesto de prueba, donde el compuesto de prueba interacciona con los componentes de la muestra de sangre u otro lïquido biolïgico para causar una alteraciïn en la composiciïn de la muestra de sangre u otro lïquido biolïgico

(b) detener la reacciïn sembrando gotas de la mezcla de sangre u otro lïquido biolïgico y el compuesto de

prueba en papel de filtro; donde el compuesto de prueba se elige entre una toxina, un alïrgeno, un autoantïgeno, una proteïna o un polisacïrido bacterianos, una proteïna viral, una proteïna o un polisacïrido fïngicos, una proteïna o un polisacïrido de un parïsito o un lipopolisacïrido bacteriano.

2. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1, donde el lïquido biolïgico que se va a analizar es lïquido cefalorraquïdeo, lïquido peritoneal, lïquido quïstico, lïquido amniïtico, lïquido de lavado, saliva, extracto celular o extracto tisular.

3. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 2 donde el trato celular deriva de lïneas celulares, cïlulas sanguïneas aisladas, cïlulas manipuladas, cïlulas transgïnicas, cïlulas transinfectadas o cualquier tipo de cïlula o tipo de cïlula alterada o manipulada.

4. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1 a 3, donde la muestra se analiza para determinar el contenido de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento y/o neurotransmisores u otros polipïptidos y proteïnas. 25

5. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1 a 4 donde la muestra se analiza para determinar el contenido de parïmetros clïnicos como CRP, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, anticuerpos especïficos (por ejemplo, especïficos del antïgeno) , transferrina, albïmina y/o transtiretina.

6. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 1 a 5, donde el efecto del compuesto de prueba se analiza mediante inmunoensayo, bioensayo, espectrometrïa de masas, HPLC, GC, GC-MS.

7. Un mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 6, donde los mïtodos de anïlisis preferidos son ensayos ELISA,

ensayos FLISA, ensayos DELFIA, ensayos de luminiscencia, ensayos de electroquimioluminiscencia, ensayo de 35 proximidad de centelleo, radioinmunoensayos, MALDI-MS, ESI-MS y MS ambiental (por ej. DESI-MS) .

8. Un mïtodo de acuerdo con las reivindicaciones 1a 7, donde el compuesto de prueba se inmoviliza en una superficie sïlida y se incuba con la muestra de sangre o lïquido biolïgico.

9. Un mïtodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 que comprende ademïs:

(c) analizar el efecto del compuesto de prueba sobre la muestra de sangre u otro lïquido biolïgico.