Análisis cuantitativo de hexosa-monofosfatos en muestras biológicas.

Un método para detectar y analizar cuantitativamente hexosa-monofosfatos en una muestra biológica,

que comprende:

(a) obtener un extracto de la muestra biológica en una forma adecuada para ionización, en donde el extracto de hexosa-monofosfato de la muestra biológica adecuada para ionización se obtiene por extracción de la muestra con un disolvente seleccionado del grupo constituido por acetonitrilo en agua, acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, e isopropanol en agua;

b) ionizar el extracto para formar una corriente de iones en fase gaseosa;

(c) seleccionar iones moleculares precursores que tienen una ratio de masa a carga de hexosa-monofosfato;

(d) fragmentar los iones moleculares precursores para obtener iones producto de hexosa-monofosfato;

(e) seleccionar los iones producto de interés de otros iones producto por su ratio de masa a carga;

(f) detectar los iones producto de interés y obtener sus intensidades iónicas; y

(g) utilizar las intensidades iónicas de los iones producto para:

(i) determinar por análisis espectral la abundancia cuantitativa de hexosa-monofosfatos en la muestra biológica; y/o

(ii) determinar la concentración de hexosa-monofosfatos o una especie particular de los mismos por comparación de las intensidades iónicas de una muestra o muestras de control que tiene(n) una concentración conocida de hexosa-monofosfatos y/o la especie particular de los mismos; y/o

(iii) determinar las ratios de abundancia iónica (IAR) que indican la cantidad relativa de una especie de hexosa-monofosfato presente en la muestra biológica.

Análisis cuantitativo de hexosa-monofosfatos en muestras biológicas

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere a un método de detección de hexosa-monofosfatos (HMPs) en muestras biológicas y usos del mismo. En una realización preferida, el método de la invención puede utilizarse para exploración de recién nacidos por galactosemia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La galactosemia es un trastorno amenazante para la vida con síntomas graves en el periodo neonatal. Está causada por deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato-uridiltransferasa (GALT) (EC.2.7.7.12) , (OMIM 230400) .

En este trastorno, la ingestión de leche causa la acumulación de galactosa en sangre y orina y conduce a una concentración intracelular elevada de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) . Gal-1-P está considerado tóxico para varios tejidos, especialmente el hígado, el cerebro, y los túbulos renales (12) . Los principales síntomas aparecen poco después de la ingestión de leche e incluyen vómitos, fallos del desarrollo, ictericia debida a lesión del hígado, y letargo. Los pacientes llegan a ponerse comatosos, y si no se inicia pronto el tratamiento, la muerte ocurre en 20 muchos casos durante las primeras semanas de vida. El tratamiento con una dieta exenta de galactosa causa regresión de los síntomas y signos en el transcurso de una semana o dos. Sin embargo, debido a la baja frecuencia de la enfermedad (aproximadamente 1:35.000 en Dinamarca) y a concienciación clínica sub-óptima, la diagnosis se retrasa a menudo o los síntomas se interpretan erróneamente como septicemia o isoinmunización, causando secuelas debidas a intervención tardía. Si bien estas consideraciones parecen recomendar la exploración neonatal, 25 esto es todavía objeto de controversia como se ilustra por dos revisiones exhaustivas recientes con conclusiones opuestas (11, 9) . No existe controversia alguna en cuanto a las implicaciones graves de la galactosemia no tratada: muerte neonatal o retraso mental severo. Los mayores problemas en la discusión son la baja frecuencia de la enfermedad, que afecta a la ratio coste-beneficio, los tests de exploración sub-óptimos, y las secuelas en el resultado a largo plazo a pesar de la diagnosis y el tratamiento tempranos, tales como deterioro intelectual, 30 trastornos en el habla, cataratas, e hipogonadismo por hipergonadotrofia (13, 14, 5) .

Existen varios métodos para la exploración neonatal por galactosemia. El más sencillo de todos consiste en examinar la orina respecto a sustancias reductoras (es decir, utilizando la solución de Fehling y Benedict) . Los ensayos empleados comúnmente para exploración neonatal utilizan muestras de manchas de sangre secas (DBSS) . 35 El test de Paigen (8) cuantifica galactosa y Gal-1-P por un ensayo microbiológico. Sin embargo, no es adecuado para automatización, es sensible al tratamiento con antibióticos de los recién nacidos o sus madres, y se requieren procedimientos cuidadosos de mantenimiento respecto a bacterias. La medida de la actividad de GALT es la base del test de Beutler (1, 2) . GALT es sensible a desactivación por calor o humedad, causando resultados positivos falsos de la exploración. Los ensayos de Paigon y Petler en combinación son utilizados por muchos laboratorios de 40 exploración (11) y pueden detectar deficiencias en GALT, galactoquinasa, y galactosa-epimerasa, pero tienen tasas relativamente altas de positivos falsos (11) . Estos trastornos pueden ser detectados también por el ensayo de fosfatasa alcalina-galactosa deshidrogenasa (3, 4) .

Fenn et al (2000) Journal of Mass Spectrometr y , vol. 35 pp. 218-223) describen un método para medida de 45 galactosa-I-p que requiere en primer lugar derivatización de galactosa, a fin de separar galactosa de glucosa utilizando cromatografía de gases, antes de someter la muestra a espectroscopia de masas en modo de iones positivos. Éste método es engorroso.

Feurie et al. (1998) , Journal of Chromatography, vol. 803, pp. 111-119 describen un método de detección de 50 carbohidratos fosforilados que utiliza una columna de HPLC unida a ciclodextrina, seguida de ionización por electrospray y espectroscopia de masas. El método no expone la detección de los carbohidratos fosforilados en una muestra biológica. Adicionalmente, no se expone doctrina alguna en Feurie del análisis cuantitativo de hexosa-monofosfatos o el uso de intensidades iónicas para hacer esto. Tampoco se expone un método de diagnóstico de la galactosemia. 55

El documento de Millington, C. et al, International Journal of Mass Spectrometr y and Ion Processes, 111 (1991) , 211-228 describe el análisis de marcadores de diagnóstico de trastornos genéticos en sangre y orina humanas utilizando espectrometría de masas en tándem con espectrometría de masas secundaria de líquido para obtención de perfiles de acilcarnitina. 60

Hay necesidad de un método mejorado, más exacto, rápido, eficaz en costes y más sencillo para exploración por y diagnóstico de la galactosemia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han desarrollado un método de exploración sencillo, totalmente automático, rápido y eficaz en costes para detectar y cuantificar hexosa-monofosfatos (HMPs) como se define en la reivindicación 1. El método puede utilizarse para detectar y cuantificar HMP en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Como tal, 5 el método puede utilizarse como indicador, v.g., para diagnóstico, exploración, o identificación de pacientes de riesgo por un trastorno relacionado con niveles anormales de HMP (sea relativos o absolutos) . Tales trastornos incluyen, pero no están limitados necesariamente a: galactosemia, fructosuria, intolerancia hereditaria a la fructosa, eficiencia en fructosa-1, 6-bifosfatasa, deficiencia en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, deficiencia en UDP-galactosa-4'-epimerasa (EC 5.1.3.2) , y diabetes mellitus. En una aplicación preferida, el método puede utilizarse 10 como indicador de galactosemia en recién nacidos. En una realización de la invención, el método puede utilizarse en el diagnóstico de galactosemia en recién nacidos. En otra realización, el método de la invención puede utilizarse en exploración por trastornos relacionados con HMP tales como galactosemia. En otra realización, la exploración puede ir seguida por o utilizarse en conjunción con otros métodos de diagnóstico, tales como análisis de genes.

Debe entenderse que la cuantificación, o análisis cuantitativo, como se utiliza en esta memoria, abarca cualquier manera de determinación de la cantidad relativa o absoluta (por ejemplo, concentración) de hexosa-monofosfato y/o una especie de hexosa-monofosfato en una muestra. El nivel o niveles de HMP como se utiliza en esta memoria, se refiere también a las cantidades tanto absolutas como relativas de HMP, cuando lo permite el contexto.

En la realización preferida, la invención proporciona una técnica nueva rápida para analizar cuantitativamente niveles de HMP en una muestra de sangre, preferiblemente en manchas de sangre secas, preferiblemente sobre papel de filtro u otro medio adecuado, utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS) . Este nuevo método puede ser utilizado en el diagnóstico de trastornos relacionados con HMP, tales como los arriba indicados, y preferiblemente la galactosemia. El nuevo método resuelve muchas de las limitaciones en los métodos de la técnica 25 anterior utilizados para exploración de la enfermedad.

En otra realización preferida, la invención proporciona un método para detectar y cuantificar los niveles de HMP en una muestra biológica por obtención de un extracto de HMP de la muestra biológica en una forma adecuada para ionización. "Extracto de HMP", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un extracto de la muestra biológica con 30 un disolvente adecuado para extracción de HMPs. El extracto de HMP no contiene necesariamente cantidad alguna de HMPs. En una realización preferida, la muestra se extrae con un disolvente que es más hidrófilo que el metanol. Disolventes adecuados podrían ser acetonitrilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, acetato de etilo en agua o isopropanol en agua. Más preferiblemente, el disolvente es o tiene propiedades similares a las de acetonitrilo en agua, y muy preferiblemente el disolvente es 30-70% acetonitrilo (v/v) en agua. 35

En otra realización, la muestra biológica se seca antes de la extracción. En otra realización adicional, la muestra biológica se transfiere a un medio adecuado, tal como papel de filtro, se seca y se extrae luego como anteriormente.

En otra realización, pueden utilizarse varias muestras biológicas en el método de la invención en caso aplicable, 40 tales como sangre... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar y analizar cuantitativamente hexosa-monofosfatos en una muestra biológica, que comprende:

(a) obtener un extracto de la muestra biológica en una forma adecuada para ionización, en donde el extracto de hexosa-monofosfato de la muestra biológica adecuada para ionización se obtiene por extracción de la muestra con un disolvente seleccionado del grupo constituido por acetonitrilo en agua, acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, e isopropanol en agua;

b) ionizar el extracto para formar una corriente de iones en fase gaseosa; 10

(c) seleccionar iones moleculares precursores que tienen una ratio de masa a carga de hexosa-monofosfato;

(d) fragmentar los iones moleculares precursores para obtener iones producto de hexosa-monofosfato;

(e) seleccionar los iones producto de interés de otros iones producto por su ratio de masa a carga;

(f) detectar los iones producto de interés y obtener sus intensidades iónicas; y (g) utilizar las intensidades iónicas de los iones producto para: 15

(i) determinar por análisis espectral la abundancia cuantitativa de hexosa-monofosfatos en la muestra biológica; y/o (ii) determinar la concentración de hexosa-monofosfatos o una especie particular de los mismos por comparación de las intensidades iónicas de una muestra o muestras de control que tiene (n) una concentración conocida de hexosa-monofosfatos y/o la especie particular de los mismos; y/o 20

(iii) determinar las ratios de abundancia iónica (IAR) que indican la cantidad relativa de una especie de hexosa-monofosfato presente en la muestra biológica.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra biológica se seca antes de la extracción.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se transfiere a un medio adecuado y se seca luego.

4. El método de la reivindicación 3 en donde el medio adecuado es papel de filtro.

5. El método de la reivindicación 1 en donde el disolvente es 30:70 a 70:30 (v/v) de acetonitrilo en agua.

6. El método de la reivindicación 5 en donde el disolvente es 1:1 (v/v) de acetonitrilo en agua.

7. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra biológica se selecciona del grupo constituido por: 35 sangre entera, componentes de sangre fraccionados, tejido, orina, heces, bilis, saliva, sudor u otras secreciones glandulares.

8. El método de la reivindicación 7 en donde la muestra biológica es una muestra de sangre entera.

9. El método de la reivindicación 8 en donde la muestra de sangre se transfiere a un medio adecuado, se seca y se extrae luego utilizando un disolvente adecuado para extracción de hexosa-monofosfatos.

10. El método de la reivindicación 9 en donde el medio adecuado es papel de filtro.

11. El método de la reivindicación 1, en donde los pasos (b) a (e) se realizan en un espectrómetro de masas en tándem.

12. El método de la reivindicación 11, en donde las intensidades iónicas se registran en modo de iones negativos.

13. El método de la reivindicación 1, en donde el paso (b) comprende formar la corriente de iones por ionización de electrospray o electrospray asistido neumáticamente.

14. El método de la reivindicación 1, en donde la ratio de masa a carga de los iones moleculares precursores de HMP es 259, 02 Da/e. 55

15. El método de la reivindicación 1, en donde los iones producto de interés son: [PO3]-; [H2PO4]-; y [ (C2H3O) -HPO4]-.

16. El método de la reivindicación 15, en donde las ratios de masa a carga de los iones producto de interés son: 60 78, 96 Da/e para [PO3]-; 96, 97 Da/e para [H2PO4]-; y 138, 98 para