Expansión del repertorio de los linfocitos T para incluir epítopos subdominantes mediante vacunación con antígenos administrados en forma de fragmentos proteicos o cócteles peptídicos.

Una vacuna contra una enfermedad crónica que comprende una mezcla de péptidos que consiste en péptidossolapantes adyacentes que abarcan la secuencia de aminoácidos completa de una proteína que se expresadurante la fase crónica de la enfermedad,

que también comprende un adyuvante en donde el adyuvante es un liposomacatiónico.

Expansión del repertorio de los linfocitos T para incluir epítopos subdominantes mediante vacunación con antígenos administrados en forma de fragmentos proteicos o cócteles peptídicos Campo de la invención La presente invención describe una vacuna contra enfermedades crónicas, tales como una infección bacteriana, vírica o parasitaria, o cáncer, que comprende una mezcla peptídica de péptidos solapantes que abarcan toda la secuencia de aminoácidos de una proteína que se expresa durante la fase crónica de la enfermedad, tal como una infección crónica causada por una bacteria, un virus o un parásito persistente, o de proteínas expresadas en tumores malignos, un método para preparar tales vacunas, y prevenir y tratar una enfermedad crónica.

Antecedentes generales En comparación con el número limitado de enfermedades contra las que están disponibles en la actualidad vacunas, por ahora no se han logrado desarrollar vacunas eficaces contra una gran cantidad, pese a los intentos de desarrollo. Una característica común de muchas de estas enfermedades infecciosas y del cáncer es que se desarrollan lentamente y se manifiestan como enfermedades crónicas, en donde la enfermedad se mantiene durante años a pesar de haber una respuesta inmune del hospedador. Esto produce frecuentemente como resultado una inmunopatología que, en algunos casos tales como con Chlamydia thracomatis, es la causa real de la enfermedad humana, tal como una cicatrización inflamatoria del oviducto que produce infertilidad. Para algunas enfermedades, tales como la infección por M. tuberculosis (TB) , existe una vacuna (BCG) , pero a pesar de que la vacuna puede evitar las manifestaciones agudas de la enfermedad, las bacterias no se eliminan y, por lo tanto, se establece una enfermedad crónica o latente. La TB transcurre fundamentalmente en tres fases. Durante la fase aguda, las bacterias proliferan en los órganos, hasta que la respuesta inmune se incrementa hasta el punto en que puede controlar la infección, después de lo cual la carga bacteriana alcanza un máximo y comienza a disminuir. Después de esto, se establece una fase crónica o latente, cuando la carga bacteriana se mantiene estable a un nivel bajo. En esta fase, M. tuberculosis pasa de una multiplicación activa a un estado de persistencia lenta o no replicativa, que puede durar muchos años. Sin embargo, en algunos casos de TB, la infección se puede reactivar de repente y el resultado será una enfermedad activa. Los factores que conducen a esta reactivación son en gran parte desconocidos. En otros casos, tales como Chlamydia, la infección puede permanecer asintomática, pero el proceso inflamatorio en curso puede causar más tarde manifestaciones clínicas, como la infertilidad.

La respuesta inmune a muchas de estas enfermedades complejas incluye un componente de respuesta inmune humoral y también de respuesta inmune mediada por células (IMC) . La respuesta IMC se dirige a una jerarquía de antígenos de linfocitos T y epítopos del agente patógeno. Los epítopos son tramos de aminoácidos (aa) de 7-9 aa (MHC I) y 12-15 aa (MHC II) (1) . En una enfermedad crónica vírica y bacteriana, tal como VIH, TB, así como cáncer, la jerarquía de las respuestas a epítopos cambia en el tiempo hasta unos pocos epítopos inmunodominantes que constituyen gradualmente una gran parte de la respuesta total de los linfocitos T, mientras que un gran número de otros epítopos, que tienen todos ellos el potencial para unirse a moléculas presentadoras de antígeno del MHC de clase I o Il, son subdominantes o incluso crípticos, lo que da como resultado respuestas de linfocitos T con niveles cercanos o inferiores al nivel de detección (2-6) . Si se inducen por vacunación (sin la competencia de los epítopos dominantes) , se ha descrito que las respuestas a tales epítopos subdominantes son protectoras, por ejemplo, en la TB (7) , lo que indica que los epítopos se expresan de hecho durante la infección natural y pueden ser reconocidos por células efectoras sobre el agente patógeno invasor. Una preocupación importante para el desarrollo actual de vacunas (8) , se debe a que se ha sugerido que estas respuestas pueden tener ventajas comparadas con las respuestas a epítopos inmunodominantes, mediante estudios en VIH en donde los mutantes que carecen de epítopos inmunodominantes se fugan y, por lo tanto, el sistema inmune no los detecta.

La utilización de epítopos de linfocitos T subdominantes en el diseño de vacunas ha estado impedida hasta ahora por dos obstáculos principales: i) la necesidad de un gran panel de epítopos diferentes para cubrir una población humana diversa, debido a la variación de los epítopos individuales reconocidos por individuos con diferente composición de HLA; ii) la necesidad de identificar epítopos subdominantes para los que se encuentren solo respuestas de linfocitos T de bajo nivel, próximas o por debajo del nivel de detección de los ensayos inmunológicos (por ejemplo, ELISPOT) .

Olsen et al. (7) han descrito que una vacuna basada en un epítopo subdominante de ESAT6 puede proteger contra la TB. Sin embargo, en este estudio no se utilizó una mezcla de péptidos solapantes que abarca toda la región de ESAT6.

En el documento WO01016163 se describe una vacuna contra un virus que comprende una mezcla de péptidos que consiste en péptidos que activan los linfocitos T, independientemente de su genotipo HLA. Esta solicitud ilustra el uso de mezclas de péptidos procedentes del virus de la hepatitis B, para permitir una amplia cobertura cuando se aplican para la vacunación de una población humana genéticamente diversa, eludiendo de este modo los no respondedores encontrados cuando se inmunizaba con péptidos aislados. Esta invención no ilustra el aumento dirigido con péptidos de linfocitos T dirigidos contra epítopos subdominantes de linfocitos T, pertinentes para la vacunación profiláctica y terapéutica contra enfermedades crónicas, tal y como se ilustra en la presente invención.

En el documento WO03011331 se describe una vacuna de sensibilización y refuerzo. Para evitar un aumento de la respuesta frente a epítopos dominantes y una disminución de la respuesta frente a epítopos subdominantes, la sensibilización se logra con un vector de ADN o vírico que codifica una cadena de epítopos. Después de la fase de sensibilización, los epítopos se emplean individualmente, en estructuras artificiales separadas o transportados en vehículos separados, para reforzar la respuesta, en lugar de ser administrados en forma de una estructura artificial única de ADN o vírica con poliepítopos. En cambio, la presente invención emplea tramos de secuencias de aminoácidos, que abarcan una proteína completa, en una mezcla de péptidos con un solapamiento de 6-20 aminoácidos, para la sensibilización y, opcionalmente, el refuerzo con la proteína completa, en forma de una vacuna con subunidad auxiliar o expresada en sistemas de administración víricos para, a su vez, obtener una inducción máxima de las respuestas humorales.

Los documentos WO2004/002415 y WO01/16163 describen vacunas contra infecciones crónicas causadas por una infección bacteriana, vírica o parasitaria, o cáncer, que comprenden una mezcla peptídica de péptidos sintéticos solapantes que abarcan la secuencia de un antígeno.

En el documento WO2004/002415, la vacuna se puede administrar junto con un adyuvante y en un preparado liposómico.

En el documento WO01/16163, la vacuna se muestra, por ejemplo, como una mezcla de 18 péptidos de HbcAg emulsionada en adyuvante completo de Freund.

Los documentos WO2004/002415 y WO01/16163 no describen el uso de liposomas catiónicos como un adyuvante alternativo.

En general se observa que en las enfermedades crónicas, la jerarquía de las respuestas a epítopos cambia con el tiempo hasta constituir respuestas a solo unos pocos epítopos dominantes. Sin embargo, como las respuestas contra epítopos subdominantes han resultado ser protectoras (7) y puesto que una respuesta contra estos epítopos no está causada por la enfermedad crónica en sí, una enfermedad crónica representa un objetivo obvio para una invención en donde se induce una respuesta inmune frente a una amplia gama de epítopos, incluidos los epítopos dominantes y, con mayor importancia, los subdominantes.

Compendio de la invención La presente invención describe vacunas que inducen un amplio reconocimiento de respuestas dominantes y subdominantes frente a cualquier antígeno dado. La vacuna comprende fragmentos solapantes del antígeno deseado en adyuvantes apropiados. El repertorio de linfocitos T aumenta de este modo para incluir no solo el epítopo inmunodominante reconocido cuando se emplea la molécula intacta para la inmunización o inducido... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna contra una enfermedad crónica que comprende una mezcla de péptidos que consiste en péptidos solapantes adyacentes que abarcan la secuencia de aminoácidos completa de una proteína que se expresa durante la fase crónica de la enfermedad, que también comprende un adyuvante en donde el adyuvante es un liposoma catiónico.

2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adyuvante es DDA/TDB.

3. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en donde uno o varios de los péptidos están modificados químicamente por glicosilación, lipidación, marcación con PAM3Cys o cloruro de dodecanoílo, o por inclusión de grupos prostéticos, o por contener aminoácidos adicionales, o por conjugación directa con un agonista de TLR.

4. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en donde la mezcla de péptidos se incorpora dentro de liposomas o cada péptido se incorpora individualmente dentro de liposomas antes de preparar la mezcla.

5. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en donde la longitud de los péptidos es de 10 a 30 aminoácidos.

6. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1 -5, en donde el solapamiento con el péptido adyacente es de 6-20 aminoácidos.

7. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en donde la proteína es expresada por bacterias, un virus, un parásito y tumores malignos.

8. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en donde la bacteria se selecciona entre el grupo consistente en Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae o Chlamydia trachomatis, el virus se selecciona entre el grupo consistente en virus de la hepatitis B o C y el parásito se selecciona entre el grupo consistente en especies de Leishmania o el parásito causante de la malaria, Plasmodium falciparum.

9. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, en donde los péptidos proceden de una proteína de M. tuberculosis seleccionada entre el grupo consistente en ESAT6, Ag85A, Ag85B o TB10.4, o de Chlamydia trachomatis seleccionada entre el grupo consistente en CT184, CT521, CT443, CT520, CT521, CT375, CT583, CT603, CT610 o CT681, o de un virus de la hepatitis, o de Plasmodium falciparum seleccionada entre el grupo consistente en Msp1, Msp2, Msp3, Ama1, GLURP, LSA1, LSA3 o CSP.

10. Un método para preparar una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, en donde la mezcla de péptidos se prepara por escisión proteolítica de la proteína con dos o más agentes de escisión proteolítica.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho agente de escisión proteolítica es una enzima proteolítica seleccionada entre el grupo consistente en tripsina, proteasa V-8, AspN o quimotripsina, o es un agente químico seleccionado entre el grupo consistente en CNBr o BNPS-escatol.

12. El uso de la vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad crónica en un animal, incluido un ser humano, que comprende la administración al animal.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la prevención o el tratamiento se refuerza administrando una segunda vacuna que comprende la proteína de tamaño completo abarcada por la mezcla de péptidos en un adyuvante o expresada en un sistema de administración vivo.

14. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 12-13, en donde la enfermedad crónica se selecciona entre el grupo consistente en infección por micobacterias, clamidia, hepatitis, VIH, parásito causante de la malaria y Leishmania, cáncer y diabetes.

Figura 1. Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10

Figura 11

Figura 12