Método cromatográfico para purificar proteínas que contienen FC.

Método para disminuir las impurezas de una composición que contiene una proteína con el dominio Fc de una inmunoglobulina (proteína buscada) mediante una cromatografía de proteína A que consta de las siguientes etapas:

a) uso de una fase móvil que contiene la proteína buscada sobre una fase estacionaria que lleva la proteína A, en unas condiciones en que la proteína buscada se fija a la fase estacionaria;

b) uso de un tampón de lavado con un pH comprendido entre 5 y 8 como fase móvil, que lleva como aditivos

i) arginina a una concentración de 0,1 - 1 mol/l,

ii) cloruro sódico a una concentración de 0,2 hasta 2 mol/l,

iii) un alcohol elegido del grupo formado por isopropanol, n-propanol y etanol a una concentración del 5 - 30% (p/v) y

iv) polivinilpirrolidona o un detergente a una concentración del 0,05 - 2% (p/v);

c) uso de un tampón de elución como fase móvil, en unas condiciones en que la proteína buscada es eluida de la fase estacionaria.

Método cromatográfico para purificar proteínas que contienen FC

La presente invención se refiere a métodos cromatográficos para purificar proteínas y a medios para tales métodos.

Las biomoléculas como proteínas, polinucleótidos, polisacáridos y similares tienen una creciente importancia comercial como medicamentos, productos diagnósticos, aditivos alimentarios, aditivos para detergentes y análogos, como reactivos de investigación y para muchas otras aplicaciones. La demanda de estas biomoléculas - p.ej. en el caso de las proteínas - ya no puede satisfacerse normalmente mediante el aislamiento de las moléculas a partir de sus fuentes naturales, sino que requiere el empleo de métodos de producción biotecnológicos.

La elaboración biotecnológica de proteínas suele empezar por el aislamiento del ADN que codifica la proteína deseada y su clonación en un vector de expresión adecuado. Tras la transfección del vector de expresión en células de expresión procariotas o eucariotas adecuadas y la subsiguiente selección de las células transfectadas, éstas se cultivan en termentadores para que se exprese la proteína deseada. A continuación se recolectan las células o el sobrenadante del cultivo y se procede al acabado y purificación de la proteína que contienen.

En el caso de los sistemas de expresión eucariotas, es decir mediante el uso de cultivos de células de mamíferos como por ejemplo las células CHO o NS, en los últimos 15 años se ha conseguido Incrementar 1 veces la concentración alcanzable de la proteína deseada en los cultivos celulares o en los sobrenadantes del cultivo durante la etapa de expresión. En el mismo espacio de tiempo la capacidad de fijación de los materiales cromatográficos utilizados en la posterior purificación de las proteínas solo ha aumentado 3 veces. Por esta razón hay una necesidad urgente de métodos mejorados y optimizados de purificación de biomoléculas, sobre todo de proteínas, que puedan aplicarse a escala industrial.

En el caso de los biofármacos, como por ejemplo las proteínas empleadas como medicamentos, p.ej. anticuerpos terapéuticos, aparte del rendimiento de los productos también es muy importante la separación de las impurezas. Aquí hay que distinguir entre impurezas del proceso e impurezas del producto. Las impurezas que dependen del proceso contienen componentes de las células huésped como proteínas (proteínas de célula huésped, Host cell proteins", HCP) y ácidos nucleicos procedentes del cultivo celular (como partes integrantes de los medios) o de la purificación (como por ejemplo sales o ligandos cromatográficos desprendidos). Las impurezas que dependen del producto son variantes moleculares del mismo con propiedades distintas, incluyendo formas más cortas como los precursores y los productos de descomposición hidrolítica, e incluso formas modificadas surgidas, por ejemplo, a causa de desanimaciones, glicosilaciones erróneas o puentes disulfuro mal unidos. Entre las variantes del producto también cabe citar polímeros y agregados. Otro tipo de impurezas son los contaminantes. Se consideran como tales todas las demás sustancias de naturaleza química, bioquímica o microbiológica que no pertenecen directamente al proceso de producción. Son contaminantes p.ej. los virus que pueden aparecer de manera indeseada en los cultivos celulares.

En el caso de los biofármacos las impurezas generan dudas de seguridad que se agravan cuando la administración de las proteínas terapéuticas - muy frecuente en los biofármacos - tiene lugar por inyección o infusión directa en el torrente sanguíneo. Así, por ejemplo, hay componentes de las células huésped que pueden producir reacciones alérgicas o efectos inmunopatológicos. Además las impurezas también pueden inducir una respuesta inmunitaria no deseada al producto administrado, es decir una reacción inmunitaria no deseada del paciente al agente terapéutico, hasta llegar a un choque anafiláctico de riesgo mortal. Por lo tanto se necesitan procedimientos de purificación adecuados que permitan reducir todas las sustancias no deseadas hasta una cantidad inocua. Por otra parte en el caso de los biofármacos tampoco se pueden ignorar los aspectos económicos. Así los procesos de producción y purificación no deben comprometer la rentabilidad del producto biofarmacéutico resultante. También juega un papel considerable el tiempo necesario para establecer un nuevo proceso de purificación: además de influir en los costes el desarrollo del proceso debe estar coordinado con el desarrollo preclínico y clínico del medicamento. P.ej. ciertos estudios preclínicos y todos los estudios clínicos no pueden empezar hasta disponer de suficientes cantidades del producto biofarmacéutico con un grado de pureza adecuado.

Como punto de partida para desarrollar un proceso de purificación de un anticuerpo que también se pueda realizar a gran escala puede servir p.ej. el siguiente procedimiento estándar, formado por cuatro etapas básicas: en la primera etapa la proteína buscada se aísla, se concentra y se estabiliza (captura). En la segunda etapa se eliminan los virus; en la tercera se lleva a cabo una purificación, reduciendo la mayor parte de impurezas como ácidos nucleicos, otras proteínas y endotoxinas. En la última etapa se eliminan las trazas de contaminantes que aún puedan quedar (pulido).

Además de las etapas de filtración y precipitación son muy importantes los métodos cromatográficos (de columna). La captura suele incluir, por ejemplo, una etapa de purificación por cromatografía de afinidad. Por consiguiente hoy en día se conocen numerosos métodos de cromatografía de columna y materiales cromatográficos utilizables en ella.

Las matrices de cromatografía de afinidad, también designadas en lo sucesivo como matrices de afinidad, se usan como fase estacionaria en la purificación industrial de diversas sustancias. Sobre ligandos inmovilizados se pueden concentrar y purificar específicamente sustancias que poseen una determinada afinidad por los respectivos ligandos empleados. Para la purificación industrial de anticuerpos (inmunoglobulinas), sobre todo monoclonales, ha dado buen resultado el uso de protelna A inmovilizada en la etapa inicial. La protelna A es una proteína de unos 41 kDA del Staphylococcus aureus, que se fija con gran afinidad (1 8 M -1'12 M a IgG humana) al dominio CH2/CH3 de la región Fe de las inmunoglobulinas. En la cromatografía de protelna A, las inmunoglobulinas o proteínas de fusión de la fase móvil que poseen una región Fe fijadora de proteína A se fijan específicamente al ligando de proteína A que está acoplado mediante enlace covalente a un soporte (p.ej. Sefarosa). La proteína A de Staphylococcus aureus (proteína A natural), así como la proteína A recombinante (proteína A rec.) modificada genéticamente, interactúan de forma no covalente con la región constante (fragmento Fe) de los anticuerpos. Esta interacción específica se puede aprovechar para separar eficientemente las impurezas de los anticuerpos. Mediante una variación del pH se puede anular selectivamente la interacción entre los anticuerpos y los ligandos de protelna A y liberar o eluir los anticuerpos de la fase estacionaria.

Esta efectividad de la cromatografía de afinidad se puede incrementar lavando la fase estacionaria tras la carga, lo cual significa el empleo de una fase móvil que elimine las impurezas de la fase estacionaria, pero no el producto buscado. En la cromatografía de afinidad de anticuerpos mediante matrices de proteína A se han usado tampones de lavado que contienen arginina, isopropanol, NaCI o un detergente (patentes W28312, W2719163, W278196, W2366662, Comunicación técnica de Millipore TB126EN), pero no la combinación de estos componentes en un solo tampón de lavado. En la patente US 6,87,34 B2 se describió una combinación de dos de estos componentes, una sal y un detergente, es decir un polímero como p.ej. polietilenglicol, polipropilen- glicol y copolímeros formados por los mismos.

Resumen de la presente invención

Se encontró sorprendentemente que la cromatografía de proteína A produce la protelna buscada con mayor pureza empleando una determinada combinación de componentes en un solo tampón de lavado que usando los mismos componentes por separado uno tras otro. Además el tampón de lavado de la presente invención se puede usar de manera estándar en la purificación de anticuerpos y como permite omitir etapas de optimización acorta la extensión del método.

La presente Invención se refiere a un método para disminuir las impurezas de una composición que contiene una proteína con el dominio Fe de una inmunoglobulina (protelna buscada) mediante una cromatografía de protelna A que consta de las siguientes... [Seguir leyendo]

1. Método para disminuir las impurezas de una composición que contiene una proteína con el dominio Fe de una ¡nmunoglobulina (proteína buscada) mediante una cromatografía de proteína A que consta de las siguientes etapas:

a) uso de una fase móvil que contiene la proteína buscada sobre una fase estacionaria que lleva la proteína A, en unas condiciones en que la proteína buscada se fija a la fase estacionaria;

b) uso de un tampón de lavado con un pH comprendido entre 5 y 8 como fase móvil, que lleva como aditivos

i) arginina a una concentración de ,1 -1 mol/l,

ii) cloruro sódico a una concentración de ,2 hasta 2 mol/l,

iii) un alcohol elegido del grupo formado por isopropanol, n-propanol y etanol a una concentración del 5 - 3% (p/v) y

iv) polivinilpirrolidona o un detergente a una concentración del ,5 - 2% (p/v);

c) uso de un tampón de elución como fase móvil, en unas condiciones en que la proteína buscada es eluida de la fase estacionaria.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de arginina en el tampón de lavado es de ,4 - ,6 mol/l.

3. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de cloruro sódico en el tampón de lavado es de ,9 -1,1 mol/l.

4. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el alcohol del tampón de lavado es isopropanol a una concentración del 1 - 2% (p/v).

5. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la polivinilpirrolidona (PVP) está a una concentración del ,1 - 2% (p/v).

6. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el detergente es un polioxietilen- sorbitán-monolaurato a una concentración del ,5-2% (p/v).

7. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las impurezas son proteínas de la célula huésped (HCP).

8. Tampón de lavado para la cromatografía de afinidad, con un pH de 5 hasta 8, que contiene i) arginina a una concentración de ,1 -1 mol/l,

¡i) cloruro sódico a una concentración de ,2 hasta 2 mol/l,

iii) un alcohol elegido del grupo formado por isopropanol, n-propanol y etanol a una concentración del 5 - 3% (p/v) y

iv) polivinilpirrolidona o un detergente a una concentración del ,5 - 2% (p/v).