Materiales, métodos y dispositivos para estimular y dirigir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico.

Materiales, métodos y dispositivos para estimular y dirigir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico.

La presente invención consiste en composiciones, métodos y dispositivos para inducir, estimular y dirigir la adherencia, proliferación y migración de precursores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico. Comprende sustratos electroconductores en forma de superficies o microfibras biofuncionalizadas para presentar una o varias biomoléculas de interés con el fin de controlar el comportamiento celular. Estos sustratos pueden utilizarse para estudios neurobiológicos, cultivos celulares y ensayos farmacológicos in vitro; así como para implantarse en el sistema nervioso en forma de andamios o dispositivos electrobiológicos, con el fin de promover la reparación del tejido neural o de mejorar la comunicación en la interfaz electrodo/célula neural en sistemas neuroprotésicos. Los efectos celulares se consiguen por el tipo, número y forma de unión de las moléculas a los sustratos, por las propiedades físicas de los mismos y la geometría de los andamios, por la estimulación eléctrica o por la acción combinada de estos factores.

Materiales, métodos y dispositivos para estimular y dirigir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico.

La presente invención se encuadra en el sector técnico del desarrollo y funcionalización de materiales y andamios electroconductores para aplicaciones en biomedicina, biotecnología, ingeniería eléctrica, bioingeniería, ingeniería tisular y bioquímica; y proporciona compuestos, métodos y dispositivos para inducir, estimular, controlar y dirigir la adherencia, proliferación, migración y diferenciación de progenitores neurales y el crecimiento de axones y dendritas.

Más específicamente, esta invención se refiere a composiciones y métodos de preparación y biofuncionalización de pOlímeros electroconductores, a métodos para inducir la proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico de forma dirigida, y a dispositivos y celdas para cultivo celular que incorporan estos métodos y composiciones para obtener los fenómenos neurobiológicos mencionados con fines de investigación biomédica, ensayos de fármacos, investigación de terapias celulares, y en general para el diseño de estrategias terapéuticas para las lesiones del sistema nervioso. Esta invención también se refiere a dispositivos y andamios que incorporan los métodos y composiciones en implantes con el fin de promover la reparación del tejido neural in vivo, y a sistemas neuroprotésicos que incorporan los polímeros biofuncionalizados para inducir el crecimiento axonal o dendrítico sobre o alrededor de los electrodos.

Por tanto, esta invención encuentra aplicación industrial en las áreas de biotecnología, bioingeniería, bioquímica y biomedicina. Más específicamente, la invención tiene aplicación en la industria de neuroprótesis eléctricas para estimular o registrar la actividad eléctrica neural y sustituir las funciones perdidas; así como en el diseño de neuroprótesis avanzadas para promover la reparación del tejido neural y la restitución de las funciones neurológicas tras lesiones del sistema nervioso. La presente invención también tiene aplicación en la industria biotecnológica, particularmente en el diseño de dispositivos y celdas de cultivo celular para inducir la proliferación , migración y selección de progenitores neurales y el crecimiento axonal. Finalmente, las aplicaciones pueden extenderse a la ingeniería de tejidos y órganos diferentes al

sistema nervioso, y al diseño de biosensores y otros dispositivos bioeléctricos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El desarrollo del sistema nervioso comprende una serie de fenómenos organizados temporal y espacialmente que incluyen la inducción, polarización y regionalización del tejido neural, la proliferación y migración de progenitores neurales y su diferenciación a neuronas o células gliales, el crecimiento y guía de axones y dendritas, la formación y maduración de sinapsis, y la mielinización axonal. Estos fenómenos constituyen áreas de investigación muy activas en la actualidad y existen descripciones pormenorizadas de sus mecanismos celulares y moleculares. Los procesos de proliferación y migración de progenitores neurales y el crecimiento axonal y dendrítico ocurren no solo durante el desarrollo sino también de forma fisiológica en los organismos adultos, o como respuesta a las afecciones del cerebro o la médula espinal, por lo cual son dianas de numerosas estrategias terapéuticas que intentan restituir las funciones neurológicas perdidas.

Las lesiones del sistema nelVioso central (SNC) humano se producen por patologías diversas que incluyen el trauma, la hemorragia, trastornos hipóxicos e isquémicos, neoplasias, infecciones, y enfermedades genéticas, metabólicas, inflamatorias, tóxicas y neurodegenerativas. La lesión daña las neuronas, glía y vasos sanguíneos y cursa con una serie de respuestas complejas que terminan en la cicatrización del tejido neural sin que se restauren la anatomía y las funciones normales. La longitud de las lesiones del SNC asociadas con trauma o isquemia en humanos varía desde 1 a 10 cm o incluso más. En la zona lesionada se forman cavidades y/o cicatrices fibróticas como resultado de la fagocitosis del tejido necrótico. Común a todos los tipos de lesión es la interrupción (axotomía) de un número variable de axones de distintos tractos y la muerte de neuronas y células gliales en el sitio de la lesión. En general, en el SNC adulto las neuronas muertas no son remplazadas , ni se presenta regeneración espontánea de sus axones debido a moléculas inhibitorias presentes en la zona de lesión y a limitaciones en la expresión de moléculas promotoras del crecimiento neural. Además de esos factores, las cicatrices fibróticas y las cavidades que se forman tras la lesión constituyen una barrera mecánica que impide el crecimiento regenerativo de los axones y la migración celular, y también interfieren la presentación de señales topográficas y moleculares que de otra forma ayudarían a la reparación.

En estudios previos se han transplantado células gliales en ratas con contusión medular cervical e7, cuyas lesiones son muy semejantes a las humanas en lo que respecta al daño neural y la formación de cavidades. A pesar del tamaño pequeño de las lesiones (3 mm) , el trasplante por inyección de las células llevó a la aglomeración celular dentro del tejido, lo que impidió la regeneración de los axones lesionados y provocó la colateralización aberrante y sin dirección de tractos no lesionados. Por consiguiente, además de administrar células o moléculas promotoras del crecimiento neural, para conseguir la reparación efectiva del tejido deben implantarse estructuras tridimensionales que den soporte, estimulen y guíen el crecimiento axonal y la migración celular a través de la zona de lesión. En este sentido, diversos autores han señalado la necesidad de implantar un "puente~ o "andamio~ fabricado con materiales artificiales en forma de tubos o fibras recubiertas de moléculas para estimular la adhesión y el crecimiento axonal y guiarlo a través de la zona de lesión. Se han evaluado distintas estructuras para la reparación de la médula espinal, usualmente compuestas por materiales no electroconductores y sin funcionalización específica para inducir el crecimiento neural, por ejemplo agarosa, hidrogel alginato, polímeros y copolímeros del ácido poli (D, L-láctico) ó péptidos degradables. En general, estos implantes mostraron buena biocompatibilidad pero efectos pequeños en cuanto a la reparación del tejido y la recuperación funcional. Algunas de las patentes y publicaciones existentes relacionadas con andamios para ingeniería tisular incluyen funcionalización de fibras con heparina / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , explotando las múltiples dianas celulares que tiene este factor de crecimiento y su participación en la reparación de diversos tejidos.

También se han desarrollado andamios tridimensionales que incorporan fibras para ingeniería tisular, con aplicaciones propuestas para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso. Las patentes WO 2007/146261 y WO 2007/090102 reivindican andamios compuestos por nanofibras alineadas de polímeros biodegradables y funcionalizados con biomoléculas para la reparación de la piel, vasos sanguíneos, músculo y nervio periférico. La patente WO 2006/138718 describe andamios tridimensionales para aplicaciones en ingeniería tisular, compuestos por nanofibras fabricadas a partir de matriz extracelular. La patente WO 2011 /123798 específicamente reivindica andamios para la reparación de nervios periféricos o de la médula espinal. En este caso, la estructura la componen fibras alineadas sobre un material de soporte que se curva de forma perpendicular a la dirección general de las fibras. Las fibras tienen un diámetro entre 1 y 1, 2 micras y se fabrican a partir de ácido poli-láctico o ácido poli-Iáctico-co-glicólico.

La utilidad de los andamios para la reparación neural será mayor si se utilizan materiales electroconductores para su fabricación. De esta forma, sería posible aplicar estímulos eléctricos a través del propio sustrato sobre el que crecen las células neurales, haciendo posible el control dinámico de su comportamiento. La electroestimulación puede actuar directamente sobre las células mediante la generación de potenciales de acción en el axón o la modulación del potencial de membrana en los progenitores y células gliales, o influir indirectamente sobre ellas al modificar las moléculas presentes en la interfase electrodo/célula e incluso electrosecretar factores tróficos u otras moléculas desde la superficie electroconductora. En la elección de los materiales electroconductores... [Seguir leyendo]

1. Material biofuncionalizado que comprende:

a) un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, metaloides o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o cualquiera de sus combinaciones.

b) un polímero electroconduclor dopado con PSS-co-MA y unido al soporte de (a) , e) al menos una molécula con actividad biológica unida a la superficie polimérica de forma directa o a través de al menos una molécula puente.

2. Material según la reivindicación anterior donde el soporte se selecciona de entre Au, Si, Pt, Ir, Ti o sus óxidos, composites o aleaciones.

3. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el soporte es una microfibra con diámetro entre 2 y 15 IJm.

4. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el soporte presenta nano o micro estructura.

5. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el polímero electroconductor se selecciona de entre poli (3, 4-etilenedioxitiofeno) , polipirrol o polianilina.

6. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica se selecciona de entre moléculas de adhesión celular, moléculas de la matriz extracelular, factores de crecimiento, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, gangliósidos, proteínas, péptidos, factores guía para los axones o dendritas o cualquiera de sus combinaciones.

7. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente se selecciona de entre polipéptidos, aminoácidos, péptidos, polisacáridos, anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones.

8. Material según las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente o la molécula con actividad biológica se unen al polímero electroconductor mediante adsorción espontánea, interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas o enlaces covalentes.

9. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica se une al polímero electroconductor a través de al menos dos tipos diferentes de moléculas puente.

10. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula puente es polilisina.

. Material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la molécula con actividad biológica es un complejo de heparina o heparán sulfato y un factor de crecimiento.

12. Material según la reivindicación 11 donde el factor de crecimiento se selecciona de entre bFGF, PFGF-M o combinaciones de ambos.

13. Material según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende una molécula de la matriz extracelular unida al complejo molecular heparina o heparán sulfato I factor de crecimiento.

14. Material según la reivindicación anterior donde la molécula de la matriz extracelular se selecciona de entre fibronectina o derivados, vitronectina o derivados o combinaciones de las mismas.

15. Material según la reivindicación 13 donde la molécula de la matriz extra celular se adsorbe sobre la superficie a partir del suero fetal o adulto.

16. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la molécula puente

es un anticuerpo. 17 Material según la reivindicación 16 donde la molécula puente es IgG.

18. Material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ó 16-17 donde la molécula con actividad biológica es una molécula de adhesión celular que se selecciona de la familia de las inmunoglobulinas, cadherinas, integrinas, o selectinas.

19. Material según la reivindicación 18 donde la molécula de adhesión celular es Ncadherina , L 1 ó combinaciones de ellas.

20. Procedimiento de obtención de un material biofuncionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende las siguientes etapas: a) Síntesis de un polímero electroconductor dopado con PSS-co-MA sobre un soporte que se selecciona de entre materiales de carbono, vidrio, plástico, metales o sus óxidos, metaloides o sus óxidos, polímeros, geles, productos derivados de la matriz extracelular, o combinaciones de estos materiales.

b) Funcionalización del polímero electroconductor mediante adsorción espontánea, electroadsorción o unión covalente. c) Unión directa a la superficie del polímero funcionalizado en la etapa (b) de al menos un tipo de molécula con actividad biológica o unión indirecta de dicha molécula con actividad biológica a través de al menos una molécula puente.

. Uso del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de dispositivos para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso.

22. Uso según la reivindicación 21 donde el dispositivo es una cámara de cultivo celular.

23. Uso según la reivindicación 21 donde el dispositivo es un implante.

24. Uso del material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de electrodos que se incorporan en neuroprótesis para electroestimulación del sistema nervioso.

25. Método para inducir el crecimiento neural y la reparación del sistema nervioso que comprende poner en contacto tejido del sistema nervioso con el material biofuncionalizado según la reivindicación 1 para promover la proliferación, diferenciación y/o migración de precursores gliales y que a su vez ellos estimulen el crecimiento de los axones.

26. Cámara de cultivo celular que comprende una base (1) sobre la que se encuentra dispuesto un material en forma de microfibras electroconductoras (2) , las cuales están unidas en al menos uno de sus extremos a un contacto eléctrico (3) , y que comprende además una celda (4) abierta superior e inferiormente y dispuesta sobre la base (1 ) , en cuyo interior quedan parcialmente contenidas las microfibras.

27. Cámara según la reivindicación anterior donde el material en forma de microfibras

(2) es el material biofuncionalizado según la reivindicación 1.

28. Cámara según la reivindicación 26 caracterizada porque la celda (4) es prismática y porque las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1 ) de forma paralela.

29. Cámara según la reivindicación 28 caracterizada porque la celda (4) además comprende al menos un tabique separador (6) dispuesto transversalmente a la dirección longitudinal de las microfibras (2) .

30. Cámara según la reivindicación 29 caracterizada porque el tabique separador (6) no apoya sobre la base definiendo una ranura para el paso de las microfibras (2) y de los elementos celulares que crezcan sobre ellas.

. Cámara según la reivindicación 29 caracterizada porque el tabique separador (6) comprende unos orificios para el paso de las microfibras (2) y de los elementos celulares que crezcan sobre ellas.

32. Cámara según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 caracterizada porque comprende además unos soportes (5) dispuestos en dos lados opuestos de la base (1) .

33. Cámara según la reivindicación 26 caracterizada porque la celda (4) es cilíndrica y 5 porque las microfibras (2) están dispuestas sobre la base (1) de forma radial.

34. Cámara según la rei vindicación 33 caracterizada porque la celda además comprende un anillo interior (7) , estando dispuestos al menos dos tabiques separadores (8) en dirección radial entre la celda (4) y dicho anillo interior (7) .

35. Cámara según la reivindicación 34 caracterizada porque el anillo interior tiene una

ranura o un agujero para el paso de la microfibra y de los elementos celulares que crecen sobre ella.

36. Implante que comprende el material biofuncionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.