HIDROGEL ÚTIL COMO SOPORTE INYECTABLE PARA APLICACIÓN EN TERAPIA CELULAR Y COMO SISTEMA DE LIBERACIÓN CONTROLADA DE FÁRMACOS.

Hidrogel útil como soporte inyectable para aplicación en terapia celular y como sistema de liberación controlada de fármacos.

La presente invención se refiere a hidrogeles generados "in situ", en condiciones fisiológicas, por entrecruzamiento químico de dos biopolímeros tipo elastina mediante una reacción "click chemistry". Estos hidrogeles son no citotóxicos y biocompatibles, por lo que pueden comprender células y/o principios activos y ser así empleados para la elaboración de medicamentos o como implantes en procedimientos de regeneración tisular. También son aplicables a la biocompatibilización y bioactivación de implantes sólidos mediante su recubrimiento y como sistemas para la liberación controlada de fármacos.

Hidrogel útil como soporte inyectable para aplicación en terapia celular y como sistema de liberación controlada de fármacos La presente invención se encuadra en el campo de la medicina regenerativa y de los sistemas de liberación controlada de fármacos, específicamente dentro de los hidrogeles generados “in situ”, en condiciones fisiológicas, por entrecruzamiento químico de dos biopolímeros de tipo elastina mediante una reacción “click chemistr y ”. Estos hidrogeles son no citotóxicos y biocompatibles, por lo que pueden comprender células y/o principios activos y ser así empleados para la elaboración de medicamentos o como implantes en procedimientos de regeneración tisular. También son aplicables a la biocompatibilización y bioactivación de implantes sólidos mediante su recubrimiento.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Son muchos y variados los métodos de entrecruzamiento físico y químico que han sido anteriormente desarrollados para diseñar hidrogeles biodegradables. El entrecruzamiento químico es un método altamente versátil, habiéndose utilizado muchas reacciones de entrecruzamiento quimioselectivas en la preparación de hidrogeles, tales como la polimerización radicalaria de monómeros de bajo peso molecular en presencia de agentes entrecruzantes o por polimerización radicalaria de polímeros solubles en agua derivatizados con grupos polimerizables, entrecruzamiento covalente por formación de bases de Schiff con aldehídos o por reacciones de adición con agentes entrecruzantes como el 1, 6-hexametilendiisocianato, la divinilsulfona, o polietilenglicol-ditio, entrecruzamientos por reacciones de condensación con carbodiimidas EDC, etc. También se ha descrito la formación de hidrogeles vía enzimática utilizando transglutaminasa con polietilenglicol (PEG) funcionalizado con grupos glutaminilos. Sin embargo, los agentes entrecruzantes y el disolvente utilizados suelen ser compuestos tóxicos que han de ser extraídos de estos geles antes de poder ser éstos aplicados en clínica. Además, muchos de estos agentes entrecruzantes pueden participar de reacciones no deseables con las sustancias bioactivas presentes en la matriz del hidrogel o en el entorno fisiológico.

Los métodos de entrecruzamiento hasta ahora utilizados con los recombinámeros tipo elastina (ELRs, de sus siglas en inglés “Elastin-Like Recombinamers”) implican métodos químicos de entrecruzamiento por radiación (Lee J, Macosko CW, Urr y DW, 2001; Macromolecules, 34:5968–5974) , fotoiniciación (Nagapudi K, et al., 2002, Macromolecules; 35:1730–1737) , con diferentes agentes químicos entrecruzantes (Trabbic-Carlson K, Setton LA, Chilkoti A, 2003, Biomacromolecules; 4:572–580) en solventes orgánicos o con entrecruzantes tóxicos o entrecruzamiento enzimático con transglutaminasas. Asimismo, se ha demostrado cómo copolímeros en bloque de ELRs forman redes tridimensionales físicamente entrecruzadas (Nagapudi K, et al., 2005; Macromolecules, 38 (2) :345–354) . Los hidrogeles o matrices obtenidas siguen manteniendo la capacidad de respuesta a estimulo de los polímeros que les constituyen, lo que posibilita una nueva variable para poder modular el comportamiento mecánico del hidrogel, al poder controlar el grado de solvatación de los hidrogeles de ELRs entrecruzados (Trabbic-Carlson K, Setton LA, Chilkoti A, 2003; Biomacromolecules, 4:572–580) . En concreto, se ha comprobado cómo se pueden obtener por entrecruzamiento químico haciendo uso de diferentes agentes entrecruzantes como hexametilendiisocianato o glutaraldehido, matrices o hidrogeles en forma de láminas delgadas para hacer cultivos celulares en superficie (2D) o con estructura interna adecuada para realizar cultivos en tres dimensiones (3D) y a partir de estos recombinámeros, bioprocesables y capaces de acomodar diferentes tipos de células humanas (HUVEC y HFF1) . Si el entrecruzamiento del polímero ELR se lleva a cabo sobre un molde litografiado mediante la técnica de impresión por microcontacto (“microcontact printing”) se producen matrices litografiadas con la topografía deseada, de gran interés para cultivos celulares ya que podrían permitir la orientación o guiado celular así como su confinamiento en zonas determinadas (Martín L., et al., 2009; Soft Matter, 5: 1591–1593) . Asimismo se han preparado matrices microporosas que sirven como substratos en aplicaciones en medicina regenerativa en 3D (Martín L., et al., 2009, Biomacromolecules, 10, 3015–3022) . Estos hidrogeles porosos basados en ELRs que contienen la secuencia de adhesión celular REDV específica de endotelio son biocompatibles. Además, la estructura porosa interconectada obtenida hace que sean viables en la infiltración de células HUVEC.

Otra área donde los ELR entrecruzados han encontrado su nicho es en la dosificación controlada de fármacos. El objetivo principal de la liberación controlada es conseguir la cantidad correcta del agente activo en el momento adecuado y en el lugar preciso. Este método de liberación se usa habitualmente para prolongar el tiempo en que la dosis terapéutica está presente de forma efectiva en el organismo, tratando de eliminar o minimizar las concentraciones que exceden los requerimientos terapéuticos. Aunque muchas han sido las tentativas, lo cierto es que conseguir una liberación sostenida durante tiempos prolongados no es un objetivo trivial. Así, se han empleado un amplio rango de materiales para controlar la liberación de drogas y de otros agentes activos. Entre estos materiales es destacable la utilización de sistemas poliméricos. Se han desarrollado hidrogeles constituidos por copolímeros sintéticos para ser aplicados en la liberación sostenida de fármacos. Sin embargo, los polímeros producidos por síntesis química presentan como principal problema la polidispersidad, que implica que no existe un control absoluto sobre su composición.

En contraposición a los polímeros de síntesis química, los polímeros proteicos recombinantes muestran varias propiedades interesantes como la ausencia de polidispersidad y el control absoluto sobre su composición. De entre los polímeros proteicos recombinantes, es destacable la atención que están recibiendo los ELR también en este área, como consecuencia de su comportamiento inteligente y auto-ensamblable y su biocompatibilidad. Todos estos parámetros son críticos a la hora de diseñar un sistema de liberación controlada. Como consecuencia de este atractivo, la comunidad científica ha diseñado diversas aproximaciones basadas en la utilización de ELRs concretos para dosificar fármacos. Por ejemplo, recientemente, el grupo de Chilkoti ha creado hidrogeles elastoméricos que portan residuos de cisteína espaciados periódicamente y cuyo entrecruzamiento viene mediado por puentes disulfuro (Asai D., et al., 2012, Biomaterials, 33, 5451-5458) . Aunque con esta aproximación se consigue la formación de un hidrogel bajo condiciones fisiológicas ligeramente oxidativas, los estudios realizados in vitro muestran que la liberación de la proteína tomada como fármaco modelo no se prolonga más allá de una semana. En definitiva, existe un amplio potencial de mejora en lo referente a hidrogeles elastoméricos capaces de dosificar fármacos de forma sostenida y prolongada en el tiempo.

A pesar de la enorme variedad de técnicas de entrecruzamiento propuestas en la literatura, muchos de estos métodos no pueden aplicarse en la obtención de matrices de ELR inyectables que exigen una inyección de los precursores en disolución acuosa seguida de la formación in situ del correspondiente hidrogel, debido a la toxicidad de los reactivos o de los productos secundarios de la reacción y de los disolventes orgánicos; o las cinéticas de la reacción de entrecruzamiento excesivamente lentas. Es por ello, que merece la pena destacar la obtención de matrices físicas elásticas y con diferentes topografías, a partir de copolímeros ELR con estructura de tetrabloque y carácter anfifílico. Se han preparado en condiciones fisiológicas y poseen comportamiento reversible sol-gel-sol con la temperatura, por lo que poseen grandes posibilidades de aplicación en biomedicina (Martín L., et al., 2010; Soft Matter, 6: 1121–1124) . Por otro lado, Chilkoti et al. han demostrado que se pueden formar hidrogeles biocompatibles de ELR químicamente entrecruzados en solución acuosa, en condiciones fisiológicas y con una cinética de reacción muy adecuada, gracias a la presencia de los grupos amino libres de los restos de lisina presentes en su composición con un entrecruzante organofosforado, de futura aplicación en la formación in situ de hidrogeles entrecruzados (Lim D.W.; et al., 2007; Biomacromolecules, 8 (5) :1463-1470) . Sin embargo, es deseable prescindir... [Seguir leyendo]

1. Un hidrogel que comprende un biopolímero A y un biopolímero B de tipo elastina entrecruzados directamente entre sí de manera covalente, donde cada uno de dichos biopolímeros comprende:

a) al menos 3 repeticiones del péptido SEQ ID NO: 1 (YPY’XY’’) , donde: X se selecciona de ente L-lisina, L-serina, L-tirosina, L-treonina, L-cisteina, Ácido Aspártico, Ácido Glutámico, Larginina, L-asparragina y L-Glutamina, Y’ es glicina o L-Alanina, Y y Y’’ son iguales o diferentes y son cualquier aminoácido natural, excepto L-prolina, y son distintos a X, y

b) al menos una repetición del péptido con SEQ ID NO: 2 (YPY’Y’’Y’’) ,

donde dichos biopolímeros A y B pueden ser iguales o diferentes.

2. El hidrogel según la reivindicación 1 donde X es L-lisina.

3. El hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde los biopolímeros además comprenden al menos uno de los péptidos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5.

4. El hidrogel según la reivindicación 3, donde los péptidos SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 5 están repetidos entre 2 y 250 veces.

5. El hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde al menos uno de los biopolímeros comprende un péptido que se selecciona de la lista que comprende: RGD, LDT, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, un dominio de unión a heparina o un dominio de unión a azúcares derivado de lectina y aglutinina.

6. El hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende células.

7. El hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende un principio activo.

8. Método para la obtención del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende las siguientes etapas:

a) sustitución, en el biopolímero A, del grupo reactivo del aminoácido X en al menos tres de las repeticiones de la SEQ ID NO: 1 por un grupo seleccionado de entre: grupos alquenilo, grupos alquino, grupos nitrilo, grupos carbonilo o grupos imina;

b) sustitución, en el biopolímero B, del grupo reactivo del aminoácido X en al menos tres de las repeticiones de la SEQ ID NO: 1 por grupos azida; y c) entrecruzamiento de los biopolímeros obtenidos en las etapas (a) y (b) mediante “click chemistr y ”.

9. El método según la reivindicación 8, donde la sustitución del paso (a) se lleva a cabo con grupos alquinilo.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, donde la sustitución del paso (b) se lleva a cabo mediante sustitución con azida tríflica generada “in situ”.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, donde el aminoácido X de la SEQ ID NO: 1 del biopolímero A es L-lisina, L-asparragina, L-Glutamina o L-arginina y donde la sustitución del paso (a) con grupos alquinilo se lleva a cabo mediante amidación catalizada por diciclohexilcarbodiimida, entre el grupo amino del aminoácido X de la SEQ ID NO: 1 del biopolímero A y un anhídrido de un ácido, haluro de ácido o un alcohol que porta un grupo alquino.

12. El método según la reivindicación 11, donde el anhídrido de ácido, haluro de ácido o el alcohol se seleccionan de entre: anhídrido pentinoico, haluro de propargilo o alcohol propargílico.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, donde el aminoácido X de la SEQ ID NO: 1 del biopolímero A es L-treonina, L-serina, L-cisteina, L-tirosina, Ácido Glutámico o Ácido Aspártico y donde la sustitución del paso (a) con grupos alquinilo se lleva a cabo mediante esterificación.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde la etapa (c) se lleva a cabo mediante inyección de los dos biopolímeros resultantes de las etapas (a) y (b) en forma de disolución acuosa.

15. El método según la reivindicación 14, donde la disolución acuosa tiene un pH de entre 5 y 11.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde la etapa (c) se lleva a cabo en ausencia de Cu (I) .

17. Un implante que comprende el hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. Uso del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la elaboración o recubrimiento de un implante.

19. Uso del hidrogel según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la elaboración de un medicamento.

20. Uso del hidrogel según la reivindicación 19 para la elaboración de un medicamento para la administración controlada de un principio activo.

21. Uso del hidrogel según la reivindicación 19, para la elaboración de un medicamento para la administración de células.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 para la elaboración de un medicamento para la administración combinada de células y un principio activo.