Enzimas para tratamiento de almidón.

Polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo de unión a carbohidratos,

donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% identidad con el dominio catalítico de amilasa alfa de Rhizomucor pusillus en SEC ID nº: 20, y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es un CBM que tiene al menos 75% identidad con un CBM seleccionado del grupo consistente en CBM de glucoamilasa de Aspergillus niger en la SEC ID nº: 96, el CBM de glucoamilasa de Aspergillus kawachii en la SEC ID nº: 94, o el CBM de A. glucoamilasa rolfsii en la SEC ID nº: 92.

Enzimas para tratamiento de almidón Referencia cruzada a listado de secuencias y microorganismos depositados [0001] La presente aplicación contiene información en forma de un listado de secuencias, que está anexo a la solicitud y también presentada en un soporte de datos que acompaña a esta solicitud. Además, la presente solicitud se refiere a microorganismos depositados. El contenido del soporte de datos y los microorganismos depositados están completamente incorporados aquí por referencia.

Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. Además, la invención se refiere a polipéptidos de alfa-amilasas de tipo salvaje que comprenden dominios catalíticos de alfa-amilasa útiles y/o CBMs al igual que a las secuencias de dominio catalítico y/o secuencias CBM. La invención también se refiere al uso de tales polipéptidos en un proceso de licuefacción de almidón donde el almidón se degrada en fragmentos de oligo y/o polisacáridos menores.

Antecedentes de la invención [0003] Un gran número de enzimas y procesos se han descrito para convertir el almidón en hidrolizados de almidón, tal como maltosa, glucosa o jarabes de especialidad, bien para uso como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también se puede fermentar a etanol u otros productos de fermentación, tal como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono beta lactona, o eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio) , penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.

Almidón es un polímero de peso molecular alto consistente en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente el 80% de amilopectina y 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado donde las cadenas lineales de residuos de D-glucosa en alfa-1, 4 se unen por enlaces glucosídicos alfa-1, 6.

La amilosa es un polisacárido lineal constituido de unidades de D-glucopiranosa enlazadas entre sí por enlaces glucosídicos alfa-1, 4. En el caso de convertir el almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado. El proceso de despolimerización convencional consiste en un paso de gelatinización y dos pasos del proceso consecutivo, es decir un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando un lodo de almidón acuoso se calienta, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento espectacular en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que pueda ser manipulado. Esta reducción en la viscosidad es hoy obtenida en su mayoría por degradación enzimática. Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas menores y lineales (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción es típicamente realizado a alrededor de 105-110°C durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguidos de aproximadamente 1-2 horas a alrededor de 95°C. La temperatura es luego bajada a 60°C, una glucoamilasa (también conocida como GA o AMG) o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa son agregadas, y el proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 a 72 horas.

Será aparente de la discusión anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los requisitos diferentes en cuanto a temperatura durante los varios pasos. Es así deseable poder seleccionar y/o diseñar las enzimas usadas en el proceso de modo que el proceso total se puede realizar sin tener que gelatinizar el almidón. Tales procesos de "almidón crudo" son las patentes de EEUU Nos. 4, 591, 560, 4, 727, 026, y 4, 009, 074, patente EP nº 0171218 y solicitud de patente danesa PA 2003 00949. La presente invención divulga polipéptidos diseñados para, entre otras cosas, tales procesos y que incluyen una secuencia de aminoácidos de un CBM y una secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de almidón. WO2004/055178 divulga el dominio catalítico de una alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus. WO98/016633 divulga una alfa-amilasa bacteriana híbrida usada en licuefacción. Enzimas híbridas son el objeto de WO 9814601, WO0077165, y PCT/US2004/020499

Resumen de la invención [0008] El presente inventor ha descubierto sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM) a ciertas alfa-amilasas la actividad y especificidad se pueden alterar aumentando así la eficacia de varios procesos degradantes de almidón, por ejemplo, que comprenden degradación de almidón crudo, por ejemplo, no gelatinizado y/o almidón gelatinizado. También cambiando un CBM por otro la actividad y especificidad pueden ser alteradas.

Tales híbridos consistentes en un polipéptido con actividad de alfa-amilasa y un módulo de unión de carbohidrato, principalmente teniendo afinidad para almidón, tienen la ventaja sobre alfa-amilasas existentes que por selección de un dominio catalítico con propiedades deseadas por ejemplo, el perfil de pH, el perfil de temperatura, la resistencia a la oxidación, la estabilidad de calcio, la afinidad de sustrato o el perfil de producto se puede combinar con un módulo de unión de carbohidrato con afinidades de enlace más fuertes o más débiles, por ejemplo, afinidades específicas para amilosa, afinidades específicas para amilopectina o afinidades para estructura específica en el carbohidrato. Así la invención se refiere a híbridos con propiedades alteradas relativamente a la alfa-amilasa sin el CBM y/o con respecto a amilasas del estado de la técnica, tal como teniendo estabilidad aumentada y/o actividad a bajo pH, por ejemplo, a pH por debajo de 4, tal como a 3.5, actividad aumentada hacia almidón granulado, y/o degradación aumentada de almidón granulado a bajo pH incluso en ausencia de glucoamilasa o a niveles de glucoamilasa baja, y/o con perfil de producto alterado.

Debido a la actividad de hidrólisis superior de este polipéptido el proceso de conversión de almidón total se puede realizar sin tener que gelatinizar el almidón, es decir, los polipéptidos hidrolizan almidón granulado en un proceso de almidón crudo al igual que almidón completamente o parcialmente gelatinizado en un proceso de almidón tradicional.

Por consiguiente la invención proporciona en un primer aspecto un polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% de identidad al dominio catalítico de alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus en SEC ID nº: 20, y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es un CBM que tiene al menos 75% de identidad a un CBM seleccionado del grupo consistente en CBM de glucoamilasa de Aspergillus niger en SEC ID nº: 96, el CBM de glucoamilasa de Aspergillus kawachii en SEC ID nº: 94, o el CBM de glucoamilasa de A. rolfsii en SEC ID nº: 92.

En otros aspectos la invención proporciona usos del polipéptido del primer aspecto para sacarificación, en un proceso que comprende fermentación, en un proceso de conversión de almidón, en un proceso para producir oligosacáridos, por ejemplo, un proceso para producir maltodextrinas o jarabes de glucosa y/o fructosa, en un proceso para producir combustible o etanol potable, para producir una bebida, y/o en un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.

En otro aspecto la invención proporciona una composición que comprende el polipéptido del primer aspecto.

En otro aspecto la invención proporciona un proceso para sacarificar almidón, donde un almidón se trata con el polipéptido del primer aspecto.

En otro aspecto la invención proporciona un proceso que comprende; a) contactar un almidón con un polipéptido del primer aspecto; b) incubar dicho almidón con dicho polipéptido; c) fermentar para producir un producto de fermentación,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido híbrido que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo catalítico con actividad de alfa-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende al menos un módulo de unión a carbohidratos, donde dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o incluso al menos 95% identidad con el dominio catalítico de amilasa alfa de Rhizomucor pusillus en SEC ID nº: 20, y donde dicha segunda secuencia de aminoácidos es un CBM que tiene al menos 75% identidad con un CBM seleccionado del grupo consistente en CBM de glucoamilasa de Aspergillus niger en la SEC ID nº: 96, el CBM de glucoamilasa de Aspergillus kawachii en la SEC ID nº: 94, o el CBM de A. glucoamilasa rolfsii en la SEC ID nº: 92.

2. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 para licuefacción.

3. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 para sacarificación.

4. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso que comprende fermentación.

5. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso de conversión de almidón.

6. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso para producir oligosacáridos.

7. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso para producir maltodextrinas o jarabes de glucosa.

8. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso para producir combustible o etanol potable.

9. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso para producir una bebida.

10. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1 en un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.

11. Una composición que comprende un polipéptido según la reivindicación 1.

12. Un proceso para sacarificar almidón, donde un almidón se trata con el polipéptido según la reivindicación 1.

13. Proceso según la reivindicación 12, que comprende la conversión de almidón en un jarabe que contiene dextrosa y/o maltosa.

14. Proceso según la reivindicación 12 o 13, donde el almidón es gelatinizado o almidón granulado.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el almidón sacarificado se pone en contacto con un organismo fermentativo para producir un producto fermentativo.

16. Proceso según las reivindicaciones 12 a 15, donde el organismo fermentativo es una levadura y el producto fermentativo es etanol.

17. Un proceso que comprende:

(a) la puesta en contacto de un almidón con un polipéptido según la reivindicación 1;

(b) incubación de dicho almidón con dicho polipéptido;

(c) fermentación para producir un producto fermentativo,

(d) opcionalmente recuperación del producto fermentativo, donde una enzima con actividad de glucoamilasa está o bien ausente o presente en una cantidad de no más de o incluso menor que 0.5 AGU (unidades de amiloglucosidasa) /g DS (contenido de materia sólida seca) , de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.4 AGU/g DS, incluso de forma más preferible no más de o incluso menor que 0.3 AGU/g DS, y de la forma más preferible no más de o incluso menor que 0.1 AGU, tal como no más de o incluso menor que 0.05 AGU/g DS de sustrato de almidón y donde el paso a, b, c, y/o d se puede realizar separada o simultáneamente, donde 1.0 AGU se define como la cantidad de enzima, que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo las condiciones estándar 37°C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.

18. Un proceso de producción de etanol a partir de material que contiene almidón por fermentación, dicho proceso comprende:

(i) licuefacción de dicho material que contiene almidón con un polipéptido según la reivindicación 1;

(ii) sacarificación de la maceración licuada obtenida;

(iii) fermentación del material obtenido en el paso (ii) en presencia de un organismo fermentativo.

19. Proceso según la reivindicación 18, que comprende además recuperación del etanol.

20. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, donde la sacarificación y fermentación se realiza como un proceso de sacarificación y fermentación simultánea (proceso SSF) .

21. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde la alfa-amilasa ácida está presente en una cantidad de

0.01 a 10 AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida) /g DS, preferiblemente 0.1 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS.

22. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, donde la glucoamilasa y alfa-amilasa ácida se añaden en una proporción de entre 0.1 a 10 AGU/AFAU, preferiblemente 0.30 y 5 AFAU/AGU, especialmente 0.5 a 3 AFAU/AGU.

23. Secuencia de ADN que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

24. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 23.

25. Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 24.

26. Célula huésped que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 24 o un vector según la reivindicación 25.

27. Composición según la reivindicación 11, donde dicha composición comprende además una glucoamilasa.

28. Composición según las reivindicaciones 11 o 27, donde la glucoamilasa es derivada de una cepa dentro de Talaromyces sp., Aspergillus sp. Trametes sp.or Pachykytospora sp.

29. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 11.

2. 28 donde la glucoamilasa es derivada de una especie seleccionada del grupo consistente en Aspergillus niger, Talaromyces leycettanus, Talaromyces duponti, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata y Pachykytospora papyracea.

30. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 11, 27-29 para licuar y/o sacarificar un almidón gelatinizado, uno parcialmente gelatinizado o uno granulado.