Glicoproteínas producidas en plantas con una expresión suprimida de la beta 1,2-xilosiltransferasa.

Método para la expresión de glicoproteínas recombinantes, caracterizado porque las glicoproteínas recombinantes son expresadas en una planta o célula vegetal,

en el que la expresión de la ß1,2-xilosiltransferasa es suprimida o bloqueada completamente de manera que la secuencia peptídica de la glicoproteína presente menos de 50%, particularmente menos de 20%, preferentemente particularmente 0% de restos de xilosa unida por ß1,2 presentes en las proteínas expresadas en los sistemas vegetales sin xilosiltransferasa reducida, mediante la transfección con un ARN no codificante que es complementario al ARNm de una ß1,2-xilosiltransferasa endógena, que se codifica mediante una secuencia según la SEC ID nº: 8 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 227 hasta el par de bases 1831, una secuencia que es idéntica por lo menos 70% a la SEC ID nº: 8, o una secuencia que hibrida con la SEC ID nº: 8 en condiciones severas, o una secuencia que ha degenerado a SEC ID nº: 8 debido al código genético, o con un vector que codifica dicho ARN no codificante.

Glicoproteínas producidas en plantas con una expresión suprimida de la beta 1, 2-xilosiltransferasa.

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican una β1, 2-xilosil-transferasa. Además, la invención se refiere a vectores que comprenden estos polinucleótidos, a las células huésped recombinantes, a las plantas e insectos transfectados con los polinucleótidos o con ADN derivados de los mismos, respectivamente, así como a las glicoproteínas producidas en estos sistemas.

Las glicoproteínas presentan una variedad y complejidad de unidades de carbohidratos, siendo la composición y disposición de los carbohidratos característica de diferentes microorganismos. Las unidades de oligosacáridos de las glicoproteínas realizan numerosos cometidos, p. ej., son importantes en la regulación del metabolismo, están implicadas en la transmisión de las interacciones célula a célula, determinan los periodos de circulación de las proteínas en circulación y son decisivas en el reconocimiento de los epítopos en las reacciones antígeno-anticuerpo.

La glicosilación de las glicoproteínas comienza en el retículo endoplasmático (ER) , donde los oligosacáridos están unidos a las cadenas laterales de asparagina por enlaces N-glicosídicos o a cadenas laterales de serina o treonina por enlaces O-glicosídicos. Los oligosacáridos unidos por N contienen un núcleo común procedente de una unidad de pentasacárido que consta de tres restos de manosa y de dos de N-acetilglicosamina. Para modificar más las unidades de carbohidratos, las proteínas se transforman desde el ER hasta el complejo de Golgi. La estructura de las unidades de oligosacárido unidas por N de las glicoproteínas está determinada por su conformación y por la composición de las glicosiltransferasas de los compartimentos de Golgi en los que se procesan.

Se ha demostrado que la unidad central de pentasacárido de los N-glucanos de algunas plantas está sustituida por xilosa unida a β1, 2 y fucosa unida a α1, 3 (Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al., 1998, J. Exp. Bot. 49, 1463-1472) . El heptasacárido “MMXF3” constituye el tipo de oligosacárido principal en las plantas (Kurosaka et al., 1991, J. Biol.. Chem., 266, 4168-4172; Wilson y Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070) . Estas estructuras se denominan también N-glucanos complejos o N-glucanos carentes de manosa o truncados, respectivamente. Los restos α-manosil pueden estar además sustituidos por GlcNAc, a los que se unen la galactosa y la fucosa de modo que se prepara una estructura que corresponde al a-epítopo humano de Lewis (Melo et al., 1997, FEBS Lett. 415, 186191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417) .

En las glicoproteínas de los mamíferos no existe la β1, 2-xilosa ni la fucosa unida a α1, 3. Se ha descubierto que la β1, 2-xilosa junto con la α1, 3-fucosa desempeña una función importante en el reconocimiento por el epítopo de los anticuerpos que se dirigen contra los oligosacáridos unidos por N a la planta y por este motivo desencadenan reacciones inmunitarias en cuerpos humanos o de animales contra estos oligosacáridos (Faye et al., 1993, Anal. Biochem. 209, 104-108) . La β1, 2-xilosa y/o la α1, 3-fucosa que contienen N-glucanos parecen ser además una de las principales causas de la reactividad alérgica cruzada muy extendida entre varios alérgenos vegetales y de insectos y

se denomina también “determinante del carbohidrato reactivo en cruz” (CCD) . Debido a la frecuente aparición de reacciones inmunológicas cruzadas, los CCD además enmascaran el diagnóstico de la alergia.

Las reacciones inmunológicas desencadenadas en el cuerpo humano por las proteínas vegetales son el principal problema en la utilización medicinal de las proteínas recombinantes humanas producidas en las plantas. Para soslayar este problema, debería evitarse la β1, 2-xilosilación junto con la α1, 3-fucosilación. Según un estudio, se aisló un mutante de la planta Arabidopsis thaliana en el cual se pierde la actividad de la N-acetil-glicosaminil transferasa I, primera enzima en la biosíntesis de los glicanos complejos. Por esta razón se interrumpe la biosíntesis de glicoproteínas complejas. No obstante, estas plantas mutantes son capaces de desarrollarse normalmente en determinadas condiciones (A. Schaewen et al., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118) .

Para bloquear específicamente la transferencia de la β1, 2-xilosa a un oligosacárido sin interferir también en otras etapas de la glicosilación, únicamente debería inactivarse esta enzima que es directamente responsable de esta glicosilación específica, es decir, la β1, 2-xilosiltransferasa. Esta transferasa que solamente aparece en las plantas y en algunas especies de animales invertebrados, p. ej., en Schistosoma sp. (Khoo et al., 1997, Glycobiology 7, 663-677) y caracoles (p. Mulder et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, 272-283) , no estando presente todavía en el hombre o en otros vertebrados, debería ser inactivada a propósito o suprimida para que las proteínas humanas que se producen en las plantas o en las células vegetales, respectivamente, no contengan ya este epítopo desencadenante de la reacción inmunitaria, como es el caso desde hace tiempo.

La β1, 2-xilosiltransferasa transfiere la D-xilosa desde la UDP-xilosa a la manosa unida en beta de los oligosacáridos unidos por N a la planta.

Esta enzima fue purificada a partir de los microsomas de la soja en 1997; Zeng et al.: J. Biol.. Chem., 272, 3134031347, 1997) . Según este artículo, el mejor receptor para la tranferencia de la xilosa fue GlcNAc2Man3GlcNAc2-T, pero GlcNAc1Man3GlcNAc2 con el GLcNAc en el ramal 3, fue también un buen receptor. Además, otros numerosos oligosacáridos unidos por N son poco receptores, especialmente aquellos con unidades de galactosa en el terminal no reductor.

En el artículo de Rayon et al. (Plant Physiology, 1999, 119, 725-733) se menciona que las proteínas de Arabidopsis están N-glicosiladas por N-glucanos del tipo ricos en manosa y por oligosacáridos que contienen xilosa y fucosa. TEZUKA et al. (Eur. J. Biochem. 203, 401-413 (1992) ) midió las actividades de diferentes enzimas, por ejemplo β1, 2xilosil-transferasa en la fracción de Golgi de las células de sicomoro cultivadas en suspensión. Ellos demostraron que la xilosa fue transferida a la manosa interna por β1, 2-xilosil-transferasa. Además, mencionaron que los oligosacáridos que contenían xilosa están ampliamente distribuidos en todo el reino vegetal si bien los oligosacáridos unidos por N que contenían xilosa se encontraban también en los gastrópodos y en las clorofíceas.

Para la supresión o inactivación específica de las proteínas es mejor realizar esto en el ámbito de las etapas de transcripción y traducción, respectivamente. Para esto es necesario aislar y secuenciar el nucleótido y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína activa.

Como se mencionó anteriormente, la β1, 2-xilosiltransferasa de soja se aisló y se purificó en 1997. Solamente se ha aislado una parte de la xilosiltransferasa (véase el documento WO 99/29835 A1, SEC. ID. nº: 6 y nº 7) , sin embargo, el ADNc completo, que codifica la proteína activa no pudo aislarse y caracterizarse hasta ahora. La razón por la cual la secuencia de nucleótidos no ha sido identificada hasta ahora pudo ser debido a los grandes problemas en el procedimiento debido a la mucha escasez de ARNm que codifica la xilosiltransferasa en los organismos, como por ejemplo la soja. Hasta ahora, aunque varios grupos han tratado de identificar la secuencia de nucleótidos completa de este gen, normalmente de soja, no fue posible producir el ADNc completo que corresponde al ARNm de la xilosiltransferasa con ayuda de métodos convencionales conocidos por ser eficaces en los casos habituales, por ejemplo con ayuda de la ampliación RACE (ampliación rápida de los extremos del ADN) . Con este método se amplían secuencias desconocidas con ayuda de cebadores de ampliación específicos. Las razones potenciales de los experimentos de RACE en 5’ sin éxito pueden ser una selección inadecuada de los cebadores específicos de PCR así

como la presencia de componentes que inhiben la transcriptasa inversa durante la síntesis del ADNc.

Un problema de la β1, 2-xilosiltransferasa es que su solubilidad y actividad depende de la presencia de detergentes.

Además del problema de la concentración sumamente baja del ARNm de la β1, 2-xilosiltransferasa existe asimismo el problema de que la estructura secundaria en el extremo 5’ del ARN parece impedir la ampliación de esta zona. En... [Seguir leyendo]

1. Método para la expresión de glicoproteínas recombinantes, caracterizado porque las glicoproteínas recombinantes son expresadas en una planta o célula vegetal, en el que la expresión de la β1, 2-xilosiltransferasa es suprimida o bloqueada completamente de manera que la secuencia peptídica de la glicoproteína presente menos de 50%, particularmente menos de 20%, preferentemente particularmente 0% de restos de xilosa unida por β1, 2 presentes en las proteínas expresadas en los sistemas vegetales sin xilosiltransferasa reducida, mediante la transfección con un ARN no codificante que es complementario al ARNm de una β1, 2-xilosiltransferasa endógena, que se codifica mediante una secuencia según la SEC ID nº: 8 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 227 hasta el par de bases 1831, una secuencia que es idéntica por lo menos 70% a la SEC ID nº: 8, o una secuencia que hibrida con la SEC ID nº: 8 en condiciones severas, o una secuencia que ha degenerado a SEC ID nº: 8 debido al código genético, o con un vector que codifica dicho ARN no codificante.

2. Método para la expresión de glicoproteínas recombinantes, caracterizado porque las glicoproteínas recombinantes son expresadas en una planta o célula vegetal, en el que la expresión de la β1, 2-xilosiltransferasa es suprimida o bloqueada completamente de manera que la secuencia peptídica de la glicoproteína presenta menos de 50%, particularmente menos de 20%, preferentemente particularmente 0% de restos de xilosa unida por β1, 2 presentes en las proteínas expresadas en los sistemas vegetales sin xilosiltransferasa reducida, en el que la reducción es mediante mutación por deleción, inserción y/o sustitución de un gen que codifica una proteína que presenta una actividad β1, 2xilosiltransferasa codificada por una secuencia según la SEC ID nº: 8 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 227 al par de bases 1831, una secuencia que es idéntica por lo menos 70% a la SEC ID nº: 8, o una secuencia que hibrida con la SEC ID nº: 8 en condiciones severas, o una secuencia que ha degenerado a la SEC ID nº: 8 debido al código genético mediante la introducción de un vector o una molécula de ADN que comprende dicha secuencia con dicha mutación por deleción, inserción y/o sustitución del gen de β1, 2-xilosiltransferasa en dichas plantas o células de manera que se produce la recombinación homóloga con el genoma de la planta o célula vegetal.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia codificante es una secuencia con una identidad de por lo menos 70% con la secuencia según la SEC ID nº: 8.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia codificante es una secuencia con una identidad de por lo menos 80% con la secuencia según la SEC ID nº: 8.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia codificante es una secuencia con una identidad de por lo menos 95% con la secuencia según la SEC ID nº: 8.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la glicoproteína es una proteína humana, especialmente una proteína humana para uso médico.