Glicoproteínas modificadas.

Método para preparar una glicoproteína modificada con la estructura general (M-L-O-N≥

CH)n-P-(CH≥N-O-L'-M')m (fórmula I), en la que M y opcionalmente M' son independientemente un resto polimérico para aumentar el peso molecular de la glicoproteína modificada, y en la que L y L' representan independientemente un grupo de unión bivalente, y en la que P representa una glicoproteína que comprende uno o más extremos terminales de glucano oxidado de dicha glicoproteína, O, N, C y H representan átomos de oxígeno, nitrógeno, carbono e hidrógeno respectivamente, n es 1-10, m es 0-50, comprendiendo el método las etapas de:

a) oxidar con iones peryodato al menos un extremo terminal de glicano presente en la glicoproteína P*, en la que P* representa una pluralidad de glicoformas para obtener la glicoproteína P-(CHO)n+m que contiene uno o más grupos aldehído, y

b) hacer reaccionar P(CHO)n+m con M-L-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-O15 N≥CH)n-P-(CHO)m, y

c) hacer reaccionar cualquier grupo aldehído que no ha reaccionado en la glicoproteína con estructura (M-L-ON≥ CH)n-P-(CHO)m con M'- L'-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-O-N≥CH)n-P- (CH≥N-O-L'-M')m;

en el que dichos iones peryodato están presentes en una cantidad de 0,1-5 equivalentes con respecto al número de extremos terminales de glicano no reductores presentes en la glicoproteína, y en el que dicha glicoproteína modificada tiene propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la glicoproteína de partida P* y ha conservado su actividad funcional, y en el que P se selecciona de FVII, FVIII y FIX.

Glicoproteínas modificadas

Campo de la invención La presente invención se refiere a la preparación de fármacos mejorados, especialmente a la preparación de glicoproteínas modificadas que tienen propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas mejoradas.

Antecedentes de la invención Las proteínas de origen biológico son muy prometedoras como agentes terapéuticos ya que con frecuencia presentan una alta eficacia y alta selectividad hacia sus ligandos naturales. Ser de origen biológico aumenta la probabilidad de que no sean tóxicas y por tanto de que sean más seguras de usar que los fármacos moleculares pequeños convencionales, ya que el organismo ya presenta mecanismos de aclaramiento bien definidos así como rutas metabólicas para su eliminación. Esto, en combinación con el hecho de que ahora pueden producirse proteínas mediante técnicas de ADN recombinante en una variedad de sistemas de expresión diferentes, lo que permite la producción a gran escala, hace que las proteínas sean candidatos a fármacos ideales. Sin embargo, las proteínas terapéuticamente interesantes tales como hormonas, receptores solubles, citocinas, enzimas, etc., con frecuencia tienen una semivida de circulación corta en el organismo, lo que reduce generalmente su utilidad terapéutica.

Las proteínas terapéuticas se eliminan de la circulación por varias vías. Para algunas proteínas farmacológicamente activas, hay receptores específicos que median en la eliminación de la circulación. Las proteínas que están 25 glicosiladas pueden aclararse mediante receptores de tipo lectina en el hígado, que sólo muestran especificidad por la parte de hidrato de carbono de esas moléculas. También se ha documentado el aclaramiento no específico por parte del riñón de proteínas y péptidos (particularmente proteínas y péptidos no glicosilados) de menos de aproximadamente 50 kDa. Se ha indicado que las asialo-glicoproteínas se aclaran más rápidamente por el hígado que las glicoproteínas nativas o las proteínas que carecen de glicosilación (Bocci (1990) Advanced Drug Deliver y Reviews 4: 149) . Las proteínas terapéuticas también se aclaran de la circulación mediante el sistema inmunitario en caso de que no sean completamente idénticas a las proteínas autólogas, ya que incluso pequeñas variaciones en la secuencia de aminoácidos o la estructura tridimensional pueden hacer que una proteína terapéutica sea inmunogénica. La respuesta inmunitaria inducida por una proteína terapéutica puede tener además diversos efectos no deseados aparte de la eliminación acelerada de la circulación: los anticuerpos pueden interferir con, o bloquear,

el efecto terapéutico mediante impedimento estérico del acceso a sitios de unión en la proteína terapéutica, los anticuerpos inducidos pueden reaccionar de manera cruzada con proteínas autólogas y de ese modo dar como resultado reacciones autoinmunitarias, etc. También resulta interesante modificar proteínas terapéuticas para dirigirlas a determinadas células, órganos o tejidos. La conjugación o fusión de proteínas a moléculas de ligandos que tienen alta afinidad por moléculas presentes en células o tejidos especializados es una manera conocida de lograr este efecto.

El documento EP 0605963 da a conocer la preparación de glicoproteínas modificadas con polímero, en la que el enlace entre el polímero y la glicoproteína es o bien una hidrazona o bien una oxima, obtenida haciendo reaccionar un aldehído de la glicoproteína con un polímero que tiene un grupo reactivo o bien hidrazina o bien oxiamina.

El documento WO 2005014024 proporciona conjugados que comprenden un polímero y una proteína unidos mediante un enlace oxima.

Por tanto, existe una necesidad general de proporcionar métodos de preparación de proteínas modificadas (terapéuticas) que muestren una semivida en suero prolongada y/o inmunogenicidad reducida y/o propiedades farmacológicas mejoradas.

Sumario de la invención 55 La presente invención proporciona la prolongación de la semivida en circulación de derivados de glicoproteína solubles, reduciendo así la cantidad de material inyectado y la frecuencia de inyección requerida para mantener niveles terapéuticamente eficaces de glicoproteína circulante para el tratamiento o la profilaxis. La corta semivida en plasma in vivo de determinadas glicoproteínas terapéuticamente activas es indeseable debido a la frecuencia y la cantidad de proteína soluble que se requerirá en el tratamiento o la profilaxis. La presente invención proporciona medios para prolongar la semivida en circulación de tales glicoproteínas con un cambio eficaz en la estructura de la glicoproteína y con el mantenimiento sustancial de la actividad biológica.

La presente invención proporciona métodos convenientes de preparación de derivados de glicoproteína, en los que se introduce una oxima de un resto polimérico en un grupo glicosilo en la glicoproteína, en los que dicha 65 glicoproteína modificada tiene propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la glicoproteína de partida.

Por tanto, la invención se refiere a un método para preparar una glicoproteína modificada con la estructura general

(M-L-O-N=CH) n-P- (CH=N-O-L’-M’) m (fórmula I)

en la que M y opcionalmente M’ son independientemente un resto polimérico para aumentar el peso molecular de la glicoproteína modificada, y en la que L y L’ representan independientemente un grupo de unión bivalente, y en la que P representa una glicoproteína que comprende uno o más extremos terminales de glucano oxidado de dicha glicoproteína, O, N, C y H representan átomos de oxígeno, nitrógeno, carbono e hidrógeno respectivamente, n es 110, m es 0-50, comprendiendo el método las etapas de a) oxidar con iones per y odato al menos un extremo terminal de glicano presente en la glicoproteína P*, en la que P* representa una pluralidad de glicoformas para obtener la glicoproteína P (CHO) n+m que contiene uno o más grupos aldehído, y

b) hacer reaccionar P (CHO) n+m con M-L-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-ON=CH) n-P- (CHO) m, y

c) hacer reaccionar cualquier grupo aldehído que no ha reaccionado en la glicoproteína con estructura (M-L-ON=CH) n-P- (CHO) m con M’-L’-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-O-N=CH) n-P (CH=N-O-L’-M’) m,

en el que dichos iones per y odato están presentes en una cantidad de 0, 1-5 equivalentes con respecto al número de extremos terminales de glicano no reductores presentes en la glicoproteína, y en el que dicha glicoproteína modificada tiene propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la glicoproteína de partida P* y ha conservado su actividad funcional.

Debe entenderse que el grupo o los grupos aldehído en P- (CHO) n+m pueden existir de manera transitoria en su (s) forma (s) de diol geminal, o como hemiacetal (es) .

También tiene que entenderse mediante P-y -P-que la glicoproteína comprende uno o más extremos terminales de glucano oxidado de dicha glicoproteína, en la que los enlaces químicos son con dichos uno o más extremos terminales de glucano.

Descripción detallada de la invención Por “una pluralidad de glicoproteínas modificadas” debe entenderse que moléculas de glicoproteína modificada individuales dentro de una preparación pueden no tener exactamente la misma estructura química, que puede variar considerablemente dentro de moléculas de glicoproteína individuales. La glicoproteína de partida P* existe normalmente en diferentes glicoformas. Por “glicoformas” quiere decirse isoformas proteicas de la misma proteína que tienen diferente polisacáridos unidos a las mismas, mediante modificaciones o bien postraduccionales o bien cotraduccionales. Además, algunas moléculas con una preparación pueden no estar modificadas en absoluto, y algunas moléculas pueden estar modificadas con más de un resto polimérico, que de nuevo puede modificarse en extremos terminales de glicano diferentes de cada glicoproteína individual. Por tanto, P* debe considerarse como 45 una pluralidad de glicoformas de proteína P.

Los términos “extremo terminal de glicano no reductor” o “extremos terminales de glicano no reductores” se refieren al extremo o los extremos terminales de un oligosacárido que no se reduce usando, por ejemplo, disolución de Fehling o reactivos de Tollens, al contrario que el extremo reductor de un oligosacárido, que se oxidan con estos reactivos. En glicoproteínas, los oligosacáridos están habitualmente unidos a la proteína en su extremo terminal reductor por medio de un enlace glicósido... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar una glicoproteína modificada con la estructura general (M-L-O-N=CH) n-P- (CH=N-O-L’-M’) m (fórmula I) , en la que M y opcionalmente M’ son independientemente un resto polimérico para aumentar el peso molecular de la glicoproteína modificada, y en la que L y L’ representan independientemente un grupo de unión bivalente, y en la que P representa una glicoproteína que comprende uno o más extremos terminales de glucano oxidado de dicha glicoproteína, O, N, C y H representan átomos de oxígeno, nitrógeno, carbono e hidrógeno respectivamente, n es 1-10, m es 0-50, comprendiendo el método las etapas de:

a) oxidar con iones per y odato al menos un extremo terminal de glicano presente en la glicoproteína P*, en la que P* representa una pluralidad de glicoformas para obtener la glicoproteína P- (CHO) n+m que contiene uno o más grupos aldehído, y

b) hacer reaccionar P (CHO) n+m con M-L-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-O15 N=CH) n-P- (CHO) m, y

c) hacer reaccionar cualquier grupo aldehído que no ha reaccionado en la glicoproteína con estructura (M-L-ON=CH) n-P- (CHO) m con M’-L’-O-NH2 para obtener la glicoproteína modificada con la estructura (M-L-O-N=CH) n-P (CH=N-O-L’-M’) m;

en el que dichos iones per y odato están presentes en una cantidad de 0, 1-5 equivalentes con respecto al número de extremos terminales de glicano no reductores presentes en la glicoproteína, y en el que dicha glicoproteína modificada tiene propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la glicoproteína de partida P* y ha conservado su actividad funcional, y en el que P se selecciona de FVII, FVIII y FIX.

2. Método según la reivindicación 1, en el que M y/o M’ se seleccionan del grupo que consiste en: un radical cargado orgánico de bajo peso molecular, que puede contener uno o más ácidos carboxílicos, aminas, ácidos sulfónicos, ácidos fosfónicos, o combinaciones de los mismos; una molécula hidrófila neutra de bajo peso molecular, tal como ciclodextrina o una cadena de polietileno opcionalmente ramificada; una molécula hidrófoba de bajo peso molecular

tal como un ácido graso o ácido cólico o derivados de los mismos; un polietilenglicol con un peso molecular promedio de 2-40 kDa; un polímero de precisión bien definido tal como un dendrímero con una masa molecular exacta que oscila entre 700 Da y 20 kDa; un polipéptido sustancialmente no inmunogénico tal como albúmina, un anticuerpo o una parte de un anticuerpo que contiene opcionalmente un dominio Fc; y un polímero orgánico de alto peso molecular.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que M y/o M’ se seleccionan del grupo que consiste en un dendrímero, poli (óxido de alquileno) (PAO) , incluyendo polialquilenglicol (PAG) , tal como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG) , PEG ramificado, poli (alcohol vinílico) (PVA) , policarboxilato, polivinilpirrolidona, poli (etileno-co-anhídrido de ácido maleico) , poli (estireno-co-anhídrido de ácido maleico) ,

dextrano, carboximetil-dextrano, HES, MPC y PHF.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la glicoproteína es un polipéptido de factor VII.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la glicoproteína modificada muestra una

biodisponibilidad que es de al menos aproximadamente el 110% de la biodisponibilidad de la glicoproteína no modificada, tal como al menos aproximadamente el 120%, aproximadamente el 130% o al menos aproximadamente el 140% de la biodisponibilidad de la glicoproteína no modificada.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dichos iones per y odato están presentes en 50 una cantidad de 0, 1-1 equivalentes, con respecto al número de extremos terminales de glicano no reductores presentes en la glicoproteína.