Gen de beta 1,2 xilosil transferasa procedente de Arabidopsis.

Molécula de ADN aislada, caracterizada porque codifica una proteína que presenta actividad de â1,

2-xilosiltransferasa y porque comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por - una secuencia SEC. ID. nº: 8 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 227 hasta el par de bases 1831 (secuencia A), - una secuencia que es por lo menos 50% idéntica a dicha secuencia A, - una secuencia que se hibrida con dicha secuencia A en condiciones severas, - una secuencia que ha degenerado en dicha secuencia A debido al código genético, o - una secuencia que es complementaria de cualquiera de las secuencias anteriores; con la condición de que se exceptúa una secuencia de ADN como la dada a conocer en el documento EP 1 033 405 A2 bajo la SEC. ID. nº: 77276 traducida en una secuencia de aminoácidos según

Gen de beta 1, 2-xilosil-transferasa procedente de Arabidopsis.

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican una β1, 2-xilosil-transferasa. Además, la invención se refiere a vectores que comprenden estos polinucleótidos, a las células huésped recombinantes, o las plantas transfectadas con los polinucleótidos o con ADN derivados de los mismos, respectivamente, así como a las glicoproteínas producidas en estos sistemas.

Las glicoproteínas presentan una variedad y complejidad de unidades de carbohidratos, siendo la composición y disposición de los carbohidratos característica de diferentes microorganismos. Las unidades de oligosacáridos de las glicoproteínas realizan numerosos cometidos, p. ej., son importantes en la regulación del metabolismo, están implicadas en la transmisión de las interacciones célula a célula, determinan los periodos de circulación de las proteínas en circulación y son decisivas en el reconocimiento de los epítopos en las reacciones antígeno-anticuerpo.

La glicosilación de las glicoproteínas comienza en el retículo endoplasmático (ER) , donde los oligosacáridos están unidos a las cadenas laterales de asparagina por enlaces N-glicosídicos o a cadenas laterales de serina o treonina por enlaces O-glicosídicos. Los oligosacáridos unidos por N contienen un núcleo común procedente de una unidad de pentasacárido que consta de tres restos de manosa y de dos de N-acetilglicosamina. Para modificar más las unidades de carbohidratos, las proteínas se transforman desde el ER hasta el complejo de Golgi. La estructura de las unidades de oligosacárido unidas por N de las glicoproteínas está determinada por su conformación y por la composición de las glicosiltransferasas de los compartimentos de Golgi en los que se procesan.

Se ha demostrado que la unidad central de pentasacárido de los N-glucanos de algunas plantas está sustituida por xilosa unida a β1, 2 y fucosa unida a α1, 3 (Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al., 1998, J. Exp. Bot. 49, 1463-1472) . El heptasacárido “MMXF3” constituye el tipo de oligosacárido principal en las plantas (Kurosaka et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, 4168-4172; Wilson y Altmann, 1998, Glycoconj. J. 15, 1055-1070) . Estas estructuras se denominan también N-glucanos complejos o N-glucanos carentes de manosa o truncados, respectivamente. Los restos α-manosil pueden estar además sustituidos por GlcNAc, a los que se unen la galactosa y la fucosa de modo que se prepara una estructura que corresponde al a-epítopo humano de Lewis (Melo et al., 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417) .

En las glicoproteínas de los mamíferos no existe la β1, 2-xilosa ni la fucosa unida a α1, 3. Se ha descubierto que la β1, 2-xilosa junto con la α1, 3-fucosa desempeña una función importante en el reconocimiento por el epítopo de los anticuerpos que se dirigen contra los oligosacáridos unidos por N a la planta y por este motivo desencadenan reacciones inmunitarias en cuerpos humanos o de animales contra estos oligosacáridos (Faye et al., 1993, Anal. Biochem. 209, 104-108) . La β1, 2-xilosa y/o la α1, 3-fucosa que contienen N-glucanos parecen ser además una de las principales causas de la reactividad alérgica cruzada muy extendida entre varios alérgenos vegetales y de insectos y se denomina también “determinante del carbohidrato reactivo en cruz” (CCD) . Debido a la frecuente aparición de reacciones inmunológicas cruzadas, los CCD además enmascaran el diagnóstico de la alergia.

Las reacciones inmunológicas desencadenadas en el cuerpo humano por las proteínas vegetales son el principal problema en la utilización medicinal de las proteínas recombinantes humanas producidas en las plantas. Para soslayar este problema, debería evitarse la β1, 2-xilosilación junto con la α1, 3-fucosilación. Según un estudio, se aisló un mutante de la planta Arabidopsis thaliana en el cual se pierde la actividad de la N-acetil-glicosaminil transferasa I, primera enzima en la biosíntesis de los glicanos complejos. Por esta razón se interrumpe la biosíntesis de glicoproteínas complejas. No obstante, estas plantas mutantes son capaces de desarrollarse normalmente en determinadas condiciones (A. Schaewen et al., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118) .

Para bloquear específicamente la transferencia de la β1, 2-xilosa a un oligosacárido sin interferir también en otras etapas de la glicosilación, únicamente debería inactivarse esta enzima que es directamente responsable de esta glicosilación específica, es decir, la β1, 2-xilosiltransferasa. Esta transferasa que solamente aparece en las plantas y en algunas especies de animales invertebrados, p. ej., en Schistosoma sp. (Khoo et al., 1997, Glycobiology 7, 663-677) y caracoles (p. Mulder et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, 272-283) , no estando presente todavía en el hombre o en otros vertebrados, debería ser inactivada a propósito o suprimida para que las proteínas humanas que se producen en las plantas o en las células vegetales, respectivamente, no contengan ya este epítopo desencadenante de la reacción inmunitaria, como es el caso desde hace tiempo.

La β1, 2-xilosiltransferasa transfiere la D-xilosa desde la UDP-xilosa a la manosa unida en beta de los oligosacáridos unidos por N a la planta.

Esta enzima fue purificada a partir de los microsomas de la soja en 1997; Zeng et al.: J. Biol.. Chem., 272, 31340-31347, 1997) . Según este artículo, el mejor receptor para la tranferencia de la xilosa fue GlcNAc2Man3GlcNAc2-T, pero GlcNAc1Man3GlcNAc2 con el GLcNAc en el ramal 3, fue también un buen receptor. Además, otros numerosos oligosacáridos unidos por N son poco receptores, especialmente aquellos con unidades de galactosa en el terminal no reductor.

En el artículo de Rayon et al. (Plant Physiology, 1999, 119, 725-733) se menciona que las proteínas de Arabidopsis están N-glicosiladas por N-glucanos del tipo ricos en manosa y por oligosacáridos que contienen xilosa y fucosa. TEZUKA et al. (Eur. J. Biochem. 203, 401-413 (1992) ) midió las actividades de diferentes enzimas, por ejemplo β1, 2-xilosil-transferasa en la fracción de Golgi de las células de sicomoro cultivadas en suspensión. Ellos demostraron que la xilosa fue transferida a la manosa interna por β1, 2-xilosil-transferasa. Además, mencionaron que los oligosacáridos que contenían xilosa están ampliamente distribuidos en todo el reino vegetal si bien los oligosacáridos unidos por N que contenían xilosa se encontraban también en los gastrópodos y en las clorofíceas.

Para la supresión o inactivación específica de las proteínas es mejor realizar esto en el ámbito de las etapas de transcripción y traducción, respectivamente. Para esto es necesario aislar y secuenciar el nucleótido y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína activa.

Como se mencionó anteriormente, la β1, 2-xilosiltransferasa de soja se aisló y se purificó en 1997. Solamente se ha aislado una parte de la xilosiltransferasa (véase el documento WO 99/29835 A1, SEC. ID. nº : 6 y nº 7) , sin embargo, el ADNc completo, que codifica la proteína activa no pudo aislarse y caracterizarse hasta ahora. La razón por la cual la secuencia de nucleótidos no ha sido identificada hasta ahora pudo ser debido a los grandes problemas en el procedimiento debido a la mucha escasez de ARNm que codifica la xilosiltransferasa en los organismos, como por ejemplo la soja. Hasta ahora, aunque varios grupos han tratado de identificar la secuencia de nucleótidos completa de este gen, normalmente de soja, no fue posible producir el ADNc completo que corresponde al ARNm de la xilosiltransferasa con ayuda de métodos convencionales conocidos por ser eficaces en los casos habituales, por ejemplo con ayuda de la ampliación RACE (ampliación rápida de los extremos del ADN) . Con este método se amplían secuencias desconocidas con ayuda de cebadores de ampliación específicos. Las razones potenciales de los experimentos de RACE en 5’ sin éxito pueden ser una selección inadecuada de los cebadores específicos de PCR así como la presencia de componentes que inhiben la transcriptasa inversa durante la síntesis del ADNc.

En el nº de registro AB 015479 de la base de datos EMBl (Nakamura et al.) se dan a conocer las secuencias del cromosoma 5 de A. thaliana. El documento EP 1 033 405 A2 da a conocer el ADN de A. Thaliana y por consiguiente los polipéptidos codificados.

Un problema de la β1, 2-xilosiltransferasa es que su solubilidad y actividad depende de la presencia de detergentes.

Además del problema de la concentración... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN aislada, caracterizada por que codifica una proteína vegetal que presenta actividad de β1, 2-xilosiltransferasa y por que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por

-una secuencia SEC ID nº : 8 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 227 hasta el par de bases 1831,

-una secuencia que es por lo menos 70% idéntica a dicha SEC ID nº : 8,

-una secuencia que es complementaria a SEC ID nº : 8;

con la condición de que se exceptúa una secuencia de ADN como la divulgada en el documento EP 1 033 405 A2 bajo la SEC ID nº : 77276 traducida en una secuencia de aminoácidos según la SEC ID nº : 77277 del documento EP 1 033 405 A2.

2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada por que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia según la SEC ID nº : 8.

3. Molécula de ADN según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que es por lo menos 95% idéntica a la secuencia SEC ID nº : 8.

4. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que comprende 1780 a 1880, particularmente 1831 pares de bases.

5. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que está asociada covalentemente a una sustancia marcadora detectable.

6. Vector biológicamente funcional, caracterizado por que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector biológicamente funcional, caracterizado por que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se encuentra en una orientación inversa con respecto al activador.

8. Método de preparación de un ADNc que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el ARN es aislado de las células vegetales, particularmente de las células foliares, y con dicho ARN se realiza una transcripción inversa tras la adición de una transcriptasa inversa y se preparan unos cebadores según la SEC ID nº : 8.

9. Método de clonación de una β1, 2-xilosiltransferasa, caracterizado por que una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 se clona en un vector que se transfecta posteriormente en una célula huésped o en un huésped, con las líneas celulares siendo obtenidas mediante selección y ampliación de células huésped transfectadas, expresando dichas líneas celulares la β1, 2-xilosiltransferasa activa.

10. Método de preparación de células huésped recombinantes, particularmente células vegetales, o plantas, en el que la producción de β1, 2-xilosiltransferasa se suprime o se interrumpe completamente, caracterizado por que el vector según la reivindicación 7 está insertado en dicha planta o célula huésped, respectivamente.

11. Método de preparación de células huésped recombinantes, particularmente células vegetales o plantas, respectivamente, caracterizado por que la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con una mutación por deleción, inserción y/o sustitución se inserta en el genoma de dichas célula huésped o planta, respectivamente, en la posición de la secuencia homóloga no mutada, en el que la producción de β1, 2-xilosiltransferasa está suprimida o completamente interrumpida.

12. Plantas o células vegetales recombinantes, caracterizadas por que se preparan de acuerdo con un método según las reivindicaciones 10 u 11 y por que su producción de β1, 2-xilosiltransferasa está suprimida o completamente interrumpida.

13. Método de selección de moléculas de ADN que codifican una β1, 2-xilosiltransferasa, en una muestra, caracterizado por que las moléculas de ADN según la reivindicación 5 se añaden a dicha muestra, uniéndose dichas moléculas a las moléculas de ADN que codifican una β1, 2-xilosiltransferasa.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado por que dicha muestra comprende el ADN genómico de una planta o de un organismo de un animal invertebrado.

15. Preparación de β1, 2-xilosiltransferasa clonada de acuerdo con un método según la reivindicación 9, caracterizado

por que presenta unas isoformas con valores de pI de entre 6, 0 y 9, 0, particularmente entre 7, 50 y 8, 00.

16. Preparación según la reivindicación 15, caracterizada por que presenta una isoforma que presenta un valor de pI

de 7, 52. 5

17. Método de preparación de unidades de carbohidrato incorporadas a plantas de glicoproteínas humanas y de otros vertebrados, caracterizado por que a una muestra que comprende una unidad de carbohidrato o cualquier glicoconjugado o una glicoproteína, se añaden respectivamente UDP-xilosa y β1, 2-xilosiltransferasa codificada por una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, de manera que la xilosa se une a dicha unidad de carbohidratos o al glicoconjugado o a dicha glicoproteína, respectivamente, en la posición β1, 2 mediante dicha β1, 2-xilosiltransferasa.