Procedimiento para el cribado de proteínas segregadas conservadas.

Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas que se unen a un polipéptido segregado conservado,

aislado o purificado, que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto dicho polipéptido con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a).

Procedimiento para el cribado de proteínas segregadas conservadas.

La presente invención se refiere a procedimientos de diagnóstico in vitro y a utilizaciones de kits de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia polipéptidos anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los Tripanosomatidae comprenden un gran grupo de protozoos parásitos, algunos de los cuales causan enfermedades importantes en los seres humanos. Los tres organismos modelo que se han estudiado más ampliamente son Tr y panosoma brucei, agente causante de la enfermedad del sueño africana, T. cruzi, responsable de la enfermedad de Chagas en América del Sur y Leishmania, que produce la leishmaniasis en Asia, América del Sur y los países mediterráneos. Quinientos millones de personas, principalmente en las zonas tropicales y subtropicales del mundo, están en situación de riesgo de contraer estas enfermedades. Se estima que más de 20 millones de personas están infectadas, lo que produce enormes sufrimientos y más de 100000 muertes al año.

La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias más importantes y afecta a 15 millones de personas en América Central y del Sur. La incidencia mundial anual de nuevos casos se estima en alrededor de 50000-200000.

El diagnóstico de la infección por T. cruzi es difícil porque los síntomas de la infección suelen estar ausentes o no son específicos, y porque los propios parásitos están por lo general por debajo del nivel de detección en los sujetos infectados (Tarleton et al., 2007) . Por lo tanto, el diagnóstico depende generalmente de la medición de anticuerpos específicos para T. cruzi producidos en respuesta a la infección.

Pruebas serológicas convencionales, tales como el ensayo de hemaglutinación indirecta, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta y el ensayo por inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) , se utilizan ampliamente en los países donde la infección es endémica. La mayoría se basan en la utilización de la totalidad o fracciones antigénicas semipurificadas de epimastigotes de T. cruzi cultivados en cultivo axénico. Un problema persistente en los ensayos convencionales es la aparición de resultados no concluyentes y falsos positivos. Por lo tanto, no existe consenso en el que la preparación de antígeno del parásito sea la mejor para la detección de anticuerpos contra T. cruzi. La Organización Mundial de la Salud y otros grupos de expertos recomiendan utilizar al menos dos pruebas en paralelo para confirmar la infección por T. cruzi. Debido a la falta de un verdadero patrón oro para el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi, el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico sigue siendo un desafío para la enfermedad de Chagas.

Se han publicado métodos ELISA de alta sensibilidad y alta especificidad utilizando péptidos recombinantes o sintéticos como antígenos. En el documento US nº 5.916.572, los compuestos y procedimientos para detectar y proteger contra la infección por T. Cruzi en personas y suministros de sangre implican polipéptidos que comprenden un epítopo de un antígeno de T. cruzi. La inclusión de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi ha supuesto una ventaja desde el punto de vista de aumento de la especificidad. No obstante, cada uno de los antígenos recombinantes presentan menor sensibilidad en comparación con la prueba convencional utilizando extractos de parásitos enteros. El uso de cócteles de antígenos recombinantes, mezclas de péptidos sintéticos o antígenos de múltiples epítopos ha demostrado aumentar la sensibilidad.

En general se supone que los factores segregados/excretados en T. cruzi son muy inmunógenos. De hecho, las formas tripomastigote liberan varios antígenos en el sobrenadante de cultivos de células infectadas. Esta mezcla compleja de antígenos, denominada TESA (antígenos excretores-secretores de tripomastigotes) , es muy inmunógena y se ha utilizado para el diagnóstico tanto de la enfermedad de Chagas aguda como crónica. Cabe destacar que los componentes de la mezcla TESA son actualmente desconocidos.

Para completar su ciclo vital, estos parásitos tienen que adaptarse y desarrollarse en un insecto vector (una mosca tsé-tsé, un hemíptero triatomino, o un tábano, respectivamente) , y en un anfitrión vertebrado. Estos organismos unicelulares han desarrollado varias estrategias para modificar su entorno, modular respuestas inmunitarias para el anfitrión, o interferir con la actividad antimicrobiana del anfitrión. Materiales segregadas por el parásito desempeñan funciones clave en estos procesos. Las proteasas segregadas que pertenecen a la familia de cisteína-o metaloproteasas se cree generalmente que están involucradas en la manipulación de las respuestas inmunitarias del anfitrión en insectos y vertebrados anfitriones. El análisis bioquímico de la gp63 extracelular de Leishmania ha puesto de manifiesto dos formas de la proteína, una liberada de la superficie de la célula y otra que aparentemente se segrega directamente. La forma segregada proporciona protección para Leishmania contra péptidos antimicrobianos procedentes de insectos. Los parásitos también pueden segregar enzimas que intervienen en los procesos nutritivos. Leishmania, al igual que otros tripanosomátidos, son auxótrofos de purinas, y por consiguiente son totalmente dependientes de la recuperación de estos nutrientes esenciales de sus anfitriones. Para satisfacer sus requisitos esenciales de purina, Leishmania segrega una nucleasa que pueden funcionar externamente del parásito para hidrolizar y acceder a ácidos nucleicos procedentes del anfitrión. Los materiales segregados también

pueden estar directamente involucrados en la invasión de células diana. Tc-TOX, una proteína formadora de poros de T. cruzi, permite al parásito escapar del endosoma y llegar al citoplasma, su entorno celular natural. Las pruebas experimentales sugieren que Leishmania también posee una proteína formadora de poros que contribuye a su liberación de anfitriones macrófagos.

En conjunto, estos resultados demuestran que los materiales segregados están involucrados en los procesos que ayudan al parásito a sobrevivir en un entorno más favorable para su propio desarrollo. Sin embargo, todos los factores en estos procesos no están actualmente identificados con claridad.

En los eucariotas, las proteínas solubles segregadas suelen contener péptidos señal con terminal N que los dirigen al aparato de desplazamiento del retículo endoplásmico (RE) . Tras el transporte vesicular desde el RE a través del aparato de Golgi a la superficie celular, proteínas de la luz de la cavidad celular se liberan en el espacio extracelular por fusión de vesículas secretoras del aparato de Golgi con la membrana plasmática.

En los tripanosomátidos, se supone que las moléculas destinadas a la superficie celular y la secreción siguen una ruta eucariota típica viajando desde el RE al aparato de Golgi, a continuación, a la superficie celular a través de una membrana del reservorio flagelar llamada bolsa flagelar. No obstante, un método proteómico reciente aplicado al secretoma de Leishmania sugirió que este parásito utiliza predominantemente secreción no clásica de las vías respiratorias para exportar directamente las proteínas, como por ejemplo la liberación de microvesículas (Silverman J.M., Chan S.K., Robinson D.P., Dwyer D.M., Nandan D., Foster L.J., Reiner N.E.: Proteomic analysis of the secretome of Leishmania donovani. Genome Biol. 2008, 9 (2) :R35) .

Los análisis comparativos han puesto de manifiesto que los genomas de los parásitos tripanosomátidos que causan la enfermedad en los seres humanos, Leishmania major, Tr y panosoma cruzi y Tr y panosoma brucei están muy conservados. Además, aproximadamente el 50% de las proteínas previstas en el genoma se anotaron como "proteínas hipotéticas, incluso si para muchos de ellos existe alguna prueba de que existe la expresión de la proteína (El-Sayed N.M., Myler P.J., Blandin G., Berriman M., Crabtree J., Aggarwal G., Caler E., Renauld H., Worthey E.A., Hertz-Fowler C. et al: Comparative genomics of tripanosomátido parasitic protozoa. Science 2005, 309 (5733) :404409; Atwood J.A., 3º , Weatherly D.B., Minning T.A., Bundy B., Cavola C., Opperdoes F.R., Orlando R., Tarleton R.L.: The Tr y panosoma cruzi proteome. Science 2005, 309 (5733) :473-476; Jones A., Faldas A., Foucher A., Hunt E., Tait A., Wastling J.M., Turner C.M.: Visualisation and analysis of proteomic data from the procyclic form of Tr y panosoma brucei. Proteomics 2006, 6 (1) :259-267) . Entre todas las “proteínas hipotéticas”... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas que se unen a un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado, que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto dicho polipéptido con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a) .

2. Procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de la enfermedad de Chagas que se unen a un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 para formar un inmunocomplejo, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto dicho anticuerpo con una muestra biológica durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un inmunocomplejo; y

b. detectar la presencia o ausencia del inmunocomplejo formado en a) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 se ha identificado mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a. analizar un supuesto polipéptido conservado a partir de especies parasitarias de protozoos para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

b. buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido, presentando dicho ortólogo un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

c. analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

d. seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

e. clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

f. transfectar células replicativas de protozoos parásitos,

g. cultivar in vitro dichas células en las condiciones de pH y temperatura que se encuentran en la naturaleza en un anfitrión infectado por una cepa parasitaria de protozoo,

h. analizar la presencia de polipéptidos segregados en las células proliferantes parasitarias de protozoos, e

i. identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86 ha sido identificado mediante un procedimiento para identificar polipéptidos conservados de parásitos tripanosomátidos que son segregados por la ruta secretora dependiente del retículo endoplásmico/aparato de Golgi, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a. analizar un supuesto polipéptido conservado de un parásito tripanosomátido para determinar si dicho polipéptido tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

b. buscar un ortólogo, en miembros de la familia relacionados, de dicho polipéptido identificado con un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

c. analizar dicho ortólogo para determinar si dicho ortólogo tiene un péptido señal de secreción en el terminal N y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

d. seleccionar el polipéptido conservado y su correspondiente ortólogo que tiene un péptido señal de secreción y un punto de corte justo detrás de dicho péptido señal,

e. clonar los genes que codifican el polipéptido seleccionado en la etapa d) mediante un vector de expresión,

f. transfectar las células replicativas de tripanosomátido en la fase de promastigotes,

g. cultivar in vitro dichas células en las condiciones de pH y temperatura que se encuentran en la naturaleza en una célula anfitriona infectada por una cepa de tripanosomátido,

h. recoger células replicativas transfectadas obtenidas en la etapa g) ,

i. incubar dichas células en un medio exento de suero durante un periodo de 1 a 10 horas, preferentemente durante un periodo de 5 a 6 horas, a una temperatura comprendida entre 25 y 27º C,

j. analizar la presencia de polipéptidos segregados por dichas células, e

k. identificar dichos polipéptidos segregados mediante un procedimiento de identificación de proteínas.

5. Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de estimulación linfocítica en un paciente que se sospecha que padece la enfermedad de Chagas, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto los linfocitos T contenidos en una muestra obtenida de dicho paciente con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86; y

b. detectar la presencia o ausencia de una respuesta proliferativa de dichos linfocitos T a dicho polipéptido.

6. Utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos indicativos de la enfermedad de Chagas, comprendiendo dicho kit de diagnóstico:

a. un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

b. un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; opcionalmente, una muestra biológica de referencia que carece de anticuerpos que se unen inmunológicamente con dicho péptido; y

c. opcionalmente, una muestra comparativa que comprende anticuerpos que pueden unirse específicamente a dicho péptido;

en la que dichos polipéptido, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.

7. Utilización de un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o ausencia de polipéptidos indicadores de la enfermedad de Chagas, comprendiendo dicho kit de diagnóstico:

a. un anticuerpo obtenido por inmunización de un animal con un polipéptido segregado conservado, aislado o purificado que consiste en la SEC. ID. nº 86;

b. un reactivo para detectar el inmunocomplejo polipéptido-anticuerpo; y

c. opcionalmente, una muestra biológica de referencia que carece de polipéptidos que se unen inmunológicamente a dicho anticuerpo; y

d. opcionalmente, una muestra comparativa que comprende polipéptidos que pueden unirse específicamente a dicho anticuerpo;

en la que dichos anticuerpo, reactivo, muestra biológica de referencia y muestra comparativa están presentes en una cantidad suficiente para llevar a cabo dicha detección.