NUEVOS MEDIOS PARA PREVENIR LA LEISHMANIASIS.

Construcciones de ácidos nucleicos, caracterizadas porque constan de ácidos nucleicos aislados en posición homosentido,

capaces de codificar una proteína inmunógena de formas promastigotos o de formas amastigotes de Leishmania, respondiendo dichos ácidos nucleicos a una de las secuencias ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 11, comprendiendo dichas secuencias un sitio de restricción EcoRV entre los dos sitios SalI y HindIII, o a un lado y otro del sitio SalI

Nuevos medios para prevenir la leishmaniasis.

La invención tiene por objeto nuevos medios para prevenir la leishmaniasis en animales y en el hombre.

Se dirige en particular a moléculas de ácidos nucleicos que codifican factores de virulencia o patogenicidad en Leishmania y a su uso para producir dichos factores con el fin de producir composiciones de vacunas contra las leishmaniasis.

Las leishmaniasis representan una de las 6 principales enfermedades parasitarias y, por este motivo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) las considera como prioritarias. Las leishmanias existen en la forma promastigoto extracelular en el interior del tubo digestivo del insecto vector (el flebotoma), y en la forma amastigote intracelular en el mamífero huésped. Parece que varias moléculas, entre ellas los lipofosfoglucanos (LPG) o una metaloproteasa llamada gp63, tienen una función importante en el poder infeccioso y la patogenicidad del parásito. Más recientemente, una familia de glicoproteínas llamadas antígenos de superficie de promastigotos, PSA (por sus siglas en inglés "Promastigote Surface Antigens"), ha despertado un nuevo interés. Estos PSA se caracterizan por la presencia de patrones repetidos ricos en leucina que pueden intervenir en las interacciones de tipo proteína/proteína y confieren una inmunidad protectora mediada por células de tipo Th 1 en el ratón. En organismos tales como bacterias o plantas, parece que los PSA estaban implicados en funciones como la adhesión celular, la resistencia a los patógenos y la transducción de señales.

Sin embargo, no se ha descrito ni sugerido ninguna función biológica en Leishmania.

Los autores de la invención han podido estudiar esta función gracias a la técnica que tienen para cultivar los promastigotos y amastigotes de Leishmania en condiciones exentas de suero y axénicas, en un medio completamente definido, es decir, cuyos constituyentes están todos identificados, y que es objeto de la patente FR 9305779 del 13 de mayo de 1993 a nombre de IRD (ex. ORSTOM). El dominio de este procedimiento les permite disponer de formas parasitarias desprovistas de contaminantes aportados hasta entonces por los medios de cultivo, y de determinantes antigénicos en forma altamente purificada.

En dicha patente FR de la solicitante, ya se ha descrito el aislamiento y la identificación de un PSA excretado/secretado (antígeno de excreción/secreción o AES de forma abreviada) de 38 kDa y de 45 kDa en el líquido sobrenadante del cultivo de L. amazoniensis.

Los autores de la invención ahora han aislado y clonado el ADNc que codifica esta proteína y han evaluado su función en la biología del parásito poniendo a punto una estrategia de transgénesis adicional. Estos trabajos han permitido poner de manifiesto la implicación de este PSA como factor de virulencia y/o de patogenicidad y elaborar construcciones que permiten sobreexpresar el gen de Leishmania que codifica este PSA, lo que permite desarrollar medios para obtener composiciones de vacunas contra las leishmaniasis.

Por lo tanto, la invención tiene como objetivo proporcionar secuencias de ácidos nucleicos capaces de codificar PSA de formas promastigotos y de formas amastigotes de Leishmania, que constituyen factores de virulencia y/o de patogenicidad.

Se dirige más en particular, a proporcionar vectores de sobreexpresión de estos PSA, así como a parásitos genéticamente modificados.

La invención se refiere además a los líquidos sobrenadantes de los medios de cultivo de los PSA obtenidos, así como a los PSA aislados, purificados, y al aprovechamiento de sus propiedades para elaborar composiciones de vacunas contra las leishmaniosis.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención corresponden a los ácidos nucleicos aislados capaces de codificar un PSA de formas promastigotos y de formas amastigotes de Leishmania, respondiendo dichos ácidos nucleicos a una de las secuencias ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 11 y que codifican los PSA de las secuencias ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 9, ID SEC Nº 10 e ID SEC Nº 12, respectivamente.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención son más en especial, secuencias de clones de ADNc que pertenecen a una familia que responde a las características ilustradas en la figura 2 y que comprenden en particular, un sitio de restricción SalI y 2 sitios de restricción HindIII, con un codón de parada situado secuencia abajo del primer sitio HindIII.

La invención se dirige en particular a los clones de ADNc de dicha familia que constan de un sitio de restricción EcoRV y/o PstI entre los dos sitios SalI y HindIII, o de un lado y otro del sitio SalI.

La invención se dirige también a proteínas inmunógenas aisladas, caracterizadas porque presentan una secuencia que es codificada por los ácido nucleicos definidos anteriormente. Se refiere en particular a las proteínas que responden a las secuencias ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 9, ID SEC Nº 10 o ID SEC Nº 12.

Estas proteínas pertenecen a dicha familia de antígenos de superficie de promastigotos (PSA de forma abreviada) y tienen regiones características ilustradas en las figuras 3A y 3B. Estas proteínas pueden modificarse después de traducción mediante N-glicosilaciones, fosforilaciones y el anclaje de un GPI. Tienen un péptido señal hidrófobo en posición carboxi terminal.

Mediante la clonación direccional de las secuencias definidas anteriormente en un vector de expresión, los autores de la invención han obtenido construcciones que permiten expresarlas en posición homosentido.

La invención se dirige por lo tanto, a construcciones de ácidos nucleicos, caracterizadas porque constan de ácidos nucleicos aislados en posición homosentido, capaces de codificar una proteína inmunógena de formas promastigotos y de formas amastigotes de Leishmania, respondiendo dichas proteínas a una de las secuencias ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 9, ID SEC Nº 10 e ID SEC Nº 12.

La invención se dirige en particular, a construcciones de ácidos nucleicos que constan de secuencias de clones de ADNc que pertenecen a una familia que responde a las características ilustradas en la figura 2, y que constan, en particular, de un sitio de restricción SalI y 2 sitios de restricción HindIII, con un codón de parada situado secuencia abajo del primer sitio HindIII.

Los clones de ADNc constan de un sitio de restricción EcoRV y/o PstI entre los dos sitios SalI y HindIII, o de un lado y otro del sitio SalI.

Las construcciones particularmente ventajosas comprenden como secuencias de ácidos nucleicos, una secuencia elegida de ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 11, codificando dichas secuencias respectivamente las proteínas de las secuencias ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 9, ID SEC Nº 10 e ID SEC Nº 12.

Las construcciones preferidas constan de dichas secuencias de ácidos nucleicos en un plásmido de multiplicación rápida tal como pTex.

Se dirige igualmente a cepas de Leishmania transfectadas con dichas construcciones, que son las formas promastigotos o las formas amastigotes.

Las cepas transfectadas preferidas, teniendo en cuenta las aplicaciones de vacunas a las que se dirige, son las cepas de L. infantum.

De forma ventajosa, los PSA se producen en gran cantidad de forma constitutiva en los parásitos.

La invención se dirige también a un procedimiento de transfección de un parásito de Leishmania, caracterizado porque se introduce en el parásito de Leishmania un vector como se ha definido antes que consta de un marcador, se seleccionan los parásitos transfectados gracias a dicho marcador, se ponen en cultivo en medio axénico y exento de suero totalmente definido, y se recupera el líquido sobrenadante del cultivo que contiene las proteínas inmunógenas presentes en concentraciones del orden de 10 a 20 veces superiores a las producidas por la cepa madre de Leishmania.

La introducción del vector en el parásito se realiza, por ejemplo, por electroporación.

La inserción de estos ácidos nucleicos en los parásitos permite aumentar el poder infeccioso de estos últimos: su capacidad para sobrevivir en el macrófago...

1. Construcciones de ácidos nucleicos, caracterizadas porque constan de ácidos nucleicos aislados en posición homosentido, capaces de codificar una proteína inmunógena de formas promastigotos o de formas amastigotes de Leishmania, respondiendo dichos ácidos nucleicos a una de las secuencias ID SEC Nº 1, ID SEC Nº 2, ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 5 e ID SEC Nº 11, comprendiendo dichas secuencias un sitio de restricción EcoRV entre los dos sitios SalI y HindIII, o a un lado y otro del sitio SalI.

2. Construcciones según la reivindicación 1, caracterizadas porque dichas secuencias de ácidos nucleicos se clonan en posición homosentido en un plásmido, tal como pTex.

3. Construcciones según la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque codifican una proteína inmunógena de formas promastigotos o de formas amastigotes de Leishmania, respondiendo estas proteínas a una de las secuencias ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, SEQ ID Nº9, ID SEC Nº 10 e ID SEC Nº 12.

4. Proteínas inmunógenas aisladas, caracterizadas porque presentan una secuencia elegida entre ID SEC Nº 6, ID SEC Nº 7, ID SEC Nº 9, ID SEC Nº 10 o ID SEC Nº 12.

5. Cepas de Leishmania genéticamente modificadas, caracterizadas porque corresponden a formas amastigotes o promastigotos de Leishmania transfectadas con una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Cepas según la reivindicación 5, caracterizadas porque se trata de cepas de L. infantum.

7. Procedimiento de transfección de un parásito de Leishmania, caracterizado porque se introduce en el parásito de Leishmania una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que consta de un marcador, se seleccionan los parásitos transfectados gracias a dicho marcador, se ponen en cultivo en medio axénico y exento de suero totalmente definido, y se recupera el líquido sobrenadante del cultivo que contiene las proteínas inmunógenas presentes en concentraciones del orden de 10 a 20 veces superiores a la producida por la cepa madre de Leishmania.