Conjugados poliméricos de factor VIII.

Un procedimiento para conjugar PEG, ácido polisiálico (PSA) o dextrano con una fracción de carbohidratos oxidada del Factor VIII que comprende poner en contacto la fracción de carbohidratos oxidada con PEG activado,

PSA y dextrano en condiciones que permitan la conjugación; en el que dicho FVIII que ha sido conjugado con PEG, PSA o dextrano conserva al menos el 50 % de la actividad biológica del FVIII nativo.

Conjugados poliméricos de factor VIII Campo de la invención

La presente invención se refiere a una construcción proteica que comprende el factor VIII (FVIII) de coagulación que está unido a al menos un polímero soluble en agua, que incluye un poli(óxldo de alqulleno) tal como polietilengllcol. Además la presente invención se refiere a procedimientos para prolongar la semlvlda in vivo del FVIII en la sangre de un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico asociado a defectos o deficiencias funcionales del FVIII.

Antecedentes de la invención

El factor VIII (FVIII) de coagulación circula en el plasma a una concentración muy baja y está unido no covalentemente al factor de von Willebrand (VWF). Durante la hemostasla, el FVIII se separa del VWF y actúa como un cofactor para la activación del factor X (FX) mediada por el factor IX activado (FlXa) mejorando la velocidad de activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas celulares.

El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena única de aproximadamente 27-33 kDa con la estructura de dominios A1-A2-B-A3-C1-C2. Cuando se purifica del plasma (es decir, "derivado del plasma" o "plasmático"), el FVIII está compuesto por una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena ligera (A3-C1-C2). La masa molecular de la cadena ligera es de 8 kDa mientras que, debido a la proteólisis en el dominio B, la cadena pesada está en el intervalo de 9-22 kDa.

El FVIII también se sintetiza como una proteína recombinante para uso terapéutico en trastornos hemorrágicos. Se han ideado diversos ensayos in vitro para para determinar la posible eficacia del FVIII recombinante (FVIIIr) como una medicina terapéutica. Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FVIII endógeno. El tratamiento con trombina in vitro del FVIII da como resultado un rápido aumento y una posterior disminución en su actividad procoagulante, medida por ensayos realizados in vitro. Esta activación e inactivación coincide con la proteólisis limitada específica tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras, que altera la disponibilidad de diferentes epítopos de unión en el FVIII, por ejemplo, permitiendo al FVIII disociarse del VWF y unirse a una superficie de fosfolípidos o alterando la capacidad de unión a ciertos anticuerpos monoclonales.

La ausencia o disfunción del FVIII se asocian al trastorno hemorrágico más frecuente, la hemofilia A. El tratamiento de elección para gestionar la hemofilia A es una terapia de sustitución con concentrados de FVIIIr o derivados de plasma. Los pacientes con hemofilia A grave con niveles de FVIII por debajo del 1 %, están generalmente en terapia profiláctica con el objetivo de mantener el FVIII por encima del 1 % entre las dosis. Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la circulación, esto se puede lograr normalmente proporcionando FVIII de dos a tres veces a la semana.

Hay muchos concentrados en el mercado para el tratamiento de la hemofilia A. Uno de estos concentrados es el producto recombinante Advate®, producido en células CHO y fabricado por Baxter Healthcare Corporation. No se añaden proteínas plasmáticas ni albúmina humana o animal en el procedimiento de cultivo celular, purificación, o formulación final de este producto.

El objetivo de muchos fabricantes de concentrados de FVIII y fármacos de polipéptldos terapéuticos es desarrollar un producto de siguiente generación con propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas mejoradas, manteniendo las restantes características del producto.

Los fármacos de polipéptldos terapéuticos se degradan rápidamente por enzimas proteolíticas y se neutralizan por anticuerpos. Esto reduce su semlvlda y su tiempo de circulación, limitando de este modo su eficacia terapéutica. Se ha mostrado que la adición de un polímero o carbohidrato soluble a un polipéptido Impide la degradación y aumenta la semivida de los polipéptldos. Por ejemplo, la PEGilación de los fármacos de polipéptldos los protege y mejora sus perfiles farmacodinámicos y farmacoclnéticos (Harris J M y Chess R B, Nat Rev Drug Dlscov 23;2:214-21). El proceso de PEGilación une unidades repetitivas de polietilenglicol (PEG) a un fármaco de polipéptidos. La PEGilación de las moléculas puede dar lugar a una resistencia aumentada de los fármacos a la degradación enzlmática, a una semivida in vivo aumentada, a una frecuencia de dosificación reducida, a una ¡nmunogenlcldad disminuida, a una estabilidad física y térmica aumentada, a una solubilidad aumentada, a una estabilidad en líquidos aumentada y a una agregación reducida.

De esta manera, la adición de un polímero soluble, tal como a través de la PEGilación, es una estrategia para mejorar las propiedades de un producto de FVIII. El estado de la técnica se documenta por diferentes patentes y solicitudes de patente:

La Patente de Estados Unidos N° 6.37.452 describe un conjugado de poli(óxido de alquileno)-FVIII o FIX, donde la proteína está unida covalentemente a un poli(óxido de alquileno) a través de los grupos carbonllo de dicho FVIII.

El documento W2825856 describe un FVIII con el dominio B suprimido unido a polietilengllcol a través de

fracciones de carbohidratos oxidados.

El documento EP1258497B1 describe un procedimiento para preparar conjugados de FVIII y un polímero biocompatible. Esta patente se complementó con una publicación de Róstin et al. (Bioconj Chem 2; 11:387-96). Los conjugados comprenden un FVIII recombinante con el dominio B suprimido modificado con monometoxi polietilenglicol. El conjugado tenía la función FVIII reducida y la actividad coagulante disminuía rápidamente con el grado de modificación.

El documento WO475923A3 describe un conjugado molecular de polímero-FVIII que comprende una pluralidad de conjugados en la que cada conjugado tiene de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a una molécula de FVIII. La molécula de FVIII tiene el dominio B suprimido.

La Patente de Estados Unidos N° 4.97.3 describe un FVIII modificado, en el que un conjugado infundible que comprende una proteína que tiene actividad FVIII se unió covalentemente a un ligando no antigénlco.

La Patente de Estados Unidos N° 6.48.72 describe conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible.

El documento W94/15625 describe un FVIII unido a polietilenglicol que tiene un peso molecular preferido no mayor de 5. Daltons.

Continua existiendo una necesidad de un FVIII que tenga un polímero soluble unido para prolongar la semivida del FVIII in vivo, por ejemplo, un FVIII PEGilado, tal como un FVIII de longitud completa que tenga, conjugado al mismo, un PEG mayor de 1. Daltons, que conserve la actividad funcional al mismo tiempo que proporcione una semivida prolongada in vivo, en comparación con un FVIII no PEGilado.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para conjugar PEG, ácido polisiálico (PSA) o dextrano a una fracción de carbohidratos oxidada del Factor VIII de acuerdo con la Reivindicación 1. La presente Invención también se refiere a una molécula proteica de acuerdo con la Reivindicación 6.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para conjugar un polimero soluble en agua con una fracción de carbohidratos oxidada del FVIII que comprende poner en contacto la fracción de carbohidratos oxidada con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permitan la conjugación. El polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG, ácido polisiálico (PSA) y dextrano. El polímero soluble en agua activado se selecciona el grupo que consiste en PEG-hidrazida, PSA-hidrazina y aldehído-dextrano activado. En otro aspecto de la presente invención, la fracción de carbohidratos se oxida por incubación en un tampón que comprende NalCU. En otro aspecto más de la presente invención, la fracción de carbohidrato oxidada de FVIII se localiza en el dominio B del FVIII.

En otra realización de la invención, se proporciona un FVIII modificado producido por el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una molécula proteica que comprende (a) una molécula de Factor VIII; y (b) al menos un polímero soluble en agua unido a dicha molécula de Factor VIII, en la que el polímero soluble en agua está unido al Factor VIII mediante una o más fracciones de carbohidratos localizadas en el dominio B del factor VIII. El polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG, PSA y dextrano.

Figuras

La Figura 1 muestra la ampliación y el aumento de masa del FVIII después de la conjugación... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para conjugar PEG, ácido polisiálico (PSA) o dextrano con una fracción de carbohidratos oxidada del Factor VIII que comprende poner en contacto la fracción de carbohidratos oxidada con PEG activado, PSA y dextrano en condiciones que permitan la conjugación; en el que dicho FVIII que ha sido conjugado con PEG,

PSA o dextrano conserva al menos el 5 % de la actividad biológica del FVIII nativo.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el PEG activado, el PSA y el dextrano son seleccionados del grupo que consiste en PEG-hidrazida, PSA-hidrazina o aldehido dextrano activado.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la fracción de carbohidratos es oxidada por incubación en un tampón que comprende Nal4.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la fracción de carbohidratos oxidada del FVIII es

localizada en el dominio B del Factor VIII.

5. Un Factor VIII modificado producido por el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una molécula proteica que comprende:

(a) una molécula de Factor VIII; y

(b) al menos uno de PSA, PEG o dextrano unido a dicha molécula de Factor VIII, en la que dicho PSA, PEG o dextrano está unido al Factor VIII mediante una o más fracciones de carbohidratos localizadas en el dominio B del Factor VIII, en la que dicha molécula conserva al menos el 5 % de la actividad biológica del FVIII nativo.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho FVIII que ha sido conjugado con el polímero 2 soluble en agua conserva al menos el 8 % de la actividad biológica del FVIII nativo.

8. La molécula de acuerdo con la reivindicación 6 en la que dicha molécula conserva al menos el 8 % de la actividad biológica del FVIII nativo.