Conjugado del factor de coagulación sanguíneo VIIA y PEG.

Un conjugado factor FVIIa-polietilenglicol, donde uno o más grupos polietilenglicol están conjugados con FVIIa mediante un grupo conector que hace de puente entre los átomos de azufre de dos residuos de cisteína que formaban un enlace disulfuro en FVIIa,

donde el conjugado tiene la estructura:**Fórmula**

donde R1 es un sustituyente que es un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno C1- 10), o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoílo o naftilo; donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; donde la unión al polímero es por medio de un enlace hidrolíticamente lábil o mediante un enlace no lábil.

Conjugado del factor de coagulación sanguíneo VIIA y PEG

La presente invención se refiere a formas conjugadas del factor de coagulación sanguíneo humano Vlla.

El factor de coagulación sanguíneo Vil (denominado en la presente FVII) es un zimógeno monocatenario, dependiente de la vitamina K, glucosllado de 53 dalton (Da), que contiene 12 enlaces disulfuro naturales (OHara et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84:5158-5162 (1987)). La proteína se produce predominantemente en el hígado. FVII participa en la cascada de coagulación sanguínea extrínseca (Figura 1). La proteína está organizada en cuatro dominios discretos: un dominio Y-carboxiglutamato (Gla) en el extremo N, dos dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico y un dominio serín proteasa en el extremo C. El zimógeno circulante muestra muy poca actividad proteasa en ausencia de su cofactor, el factor tisular (TF), que se encuentra en el subendotelio vascular. Tras el daño vascular, FVII se une a TF con una gran afinidad y se convierte en la enzima FVIIa bicatenaria y activa por escisión específica del enlace peptídico entre la arginina 152 y la isoleucina 153. La cadena ligera de FVIIa está compuesta por el Gla del extremo N y los dominios de tipo EGF y la cadena pesada está compuesta por el dominio serín proteasa. Las cadenas pesada y ligera se mantienen juntas por un enlace disulfuro único entre la cisteína 135 y la cisteína 262. Una vez activado, FVIIa cataliza rápidamente la conversión de FX en FXa y FIX en FlXa. A continuación, FXa forma un complejo con FVa para escindir la protrombina, lo que da como resultado la generación de pequeñas cantidades de trombina (Aitken, M. G. EMA, 16: 446-455 (24)). Esta generación de trombina activa los trombocitos y los cofactores V, VIII y XI en la superficie de los trombocitos. La activación conduce a la formación rápida y en gran cantidad de trombina que provoca la polimerización de fibrina y la formación de un coágulo hemostático.

Novo Nordisk ha desarrollado y comercializado FVIIa recombinante humano como NovoSeven® (eptacog alfa [activado], código ATC B2BD8). NovoSeven®, autorizado para el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o B que han desarrollado anticuerpos inhibidores contra FVIII o IX, respectivamente (Jurlander et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27: 373-383 (21); Roberts et al., Blood, 15: 3858-3864 (24)). El tratamiento ha demostrado ser seguro y eficaz desde su lanzamiento en 1996. Sin embargo, debido a la semivida relativamente corta in vivo de las proteínas (2.3 horas; condiciones de aprobación de NovoSeven®, número de referencia de la FDA 96-597) se requieren múltiples infusiones de dosis elevadas del producto (9 pg kg'1) a lo largo del tiempo durante un episodio hemorrágico único con el fin de lograr la homeostasis. La semivida corta del producto y la dosis elevada requerida para obtener el efecto terapéutico deseado excluyen el uso habitual de NovoSeven® para el tratamiento profiláctico de los hemofílicos con inhibidores. Por lo tanto, claramente se necesitan desarrollar moléculas de FVIIa que tengan una semivida mayor, que produzcan mejoras en la farmacocinética (PK, por sus siglas en inglés) y farmacodinámica (PD, por sus siglas en inglés).

La conjugación de compuestos biofarmacéuticos con polímeros biocompatibles se ha utilizado previamente con éxito para mejorar las características fisicoquímicas de los productos. Las características de las proteínas terapéuticas que se han mejorado mediante la conjugación incluyen la PK, PD y la ¡nmunogenicidad. La unión de un resto químico a una proteína puede incrementar significativamente su semivida de circulación (Jevsevar et al., Biotechnol. J., 5: 113-128 (21)). Para las especies moleculares con pesos moleculares por debajo del límite de filtración glomerular la conjugación de un resto con un peso molecular elevado previene el aclaramiento renal del producto. Asimismo, la adición de restos químicos a productos farmacéuticos puede prevenir la eliminación mediada por el receptor de la molécula mediante el impedimento estérico.

Un ejemplo de un polímero biocompatible que se ha utilizado en varios productos biofarmacéuticos comercializados es el polietilenglicol (denominado en la presente PEG). El proceso de unión covalente de una molécula de PEG a otra molécula se denomina PEGilación. Hasta la fecha, nueve productos PEGilados han recibido la aprobación de comercialización de la FDA, donde cuatro son medicamentos supervenías: Peglntron® (Schering-Plough), Pegasys® (Hoffman-La Roche), Neulasta® (Amgen) y Micera® (Hoffman-La Roche). Se han utilizado varias químicas diferentes para conjugar compuestos terapéuticos proteicos con moléculas de PEG activadas. La PEGigación aleatoria se ha utilizado con éxito para unir de manera covalente restos de PEG a proteínas a través de los grupos amino de las proteínas. Los sitios de unión han sido con frecuencia, pero no de manera exclusiva, el grupo amino £ de las cadenas laterales de los residuos de lisina. Tales reacciones aleatorias pueden producir mezclas muy complejas de conjugados con variaciones en el número y sitio de unión del resto de PEG. Incluso tras la purificación de reacciones de conjugación aleatorias, pueden estar presentes isómeros de posición que muestran características fisicoquímicas y farmacéuticas muy diferentes. Se han desarrollado varias técnicas de PEGilación específica respecto al sitio que se están aprovechando en la actualidad para producir compuestos biofarmacéuticos mejor definidos. Las estrategias que se adoptan para conseguir una PEGilación específica respecto al sitio incluyen la PEGilación dirigida al extremo N, cisteína, glicanos, disulfuros y polihistidina.

El estado de la técnica de la PEGilación de FVIIa recombinante está documentado en diferentes patentes y solicitudes de patentes:

El documento WO 98/32466 sugiere que FVII puede PEGilarse pero no contiene información adicional sobre el asunto.

El documento US 28/2651 sugiere que los polipéptidos de FVII con una actividad natural, o incrementada, que tienen una molécula de PEG conjugada mediante un residuo de cisterna introducido de manera artificial mostraron una semivida in vivo mayor.

El documento US 28/22132 describe la producción de un conjugado FVIla-ácido polisiálico que dio como resultado la molécula que mostró una semivida in vivo significativamente mayor.

El documento US 29/176967 menciona que las enzimas se pueden utilizar para introducir grupos funcionales específicos en el extremo C del polipéptido de FVII al cual se pueden acoplar polímeros biocompatibles tales como PEG.

El documento US 29/22754 describe preparaciones de FVIIa (o moléculas similares a FVIIa) donde una o más cadenas oligosacarídicas unidas a serina y/o a asparagina están modificadas cova lente mente con al menos un grupo polimérico que muestra una semivida sérica mejorada.

El documento US 21/28939 describe cómo se puede modificar glucoproteínas naturales utilizando la enzima galactosa-oxidasa para producir funcionalidades aldehido reactivas en el extremo polisacarídico. La reactividad de los aldehidos se puede utilizar a continuación para conjugar restos poliméricos a la proteína y generar un producto con características farmacológicas mejoradas.

El documento US 21/56428 sugiere que en FVIIa se pueden conseguir características farmacocinéticas mejoradas derivatizando la glucoproteína por una oxima de un resto polimérico tal como PEG en un grupo glucosílico.

El documento US 21/93934 menciona que la conjugación de restos poliméricos en factores de coagulación sanguíneos se puede conseguir más o menos uniendo en primer lugar el factor de coagulación a un anticuerpo, o anticuerpos, monoclonal que tenga afinidad por la proteína antes de hacerlo reaccionar con un polímero activado.

El documento US 21/99616 describe cómo los factores sanguíneos, incluido el FVIIa, se pueden producir con números pequeños (1-9) de polímeros hidrosolubles conjugados con ellos. Sin embargo, los autores no ejemplifican las características farmacológicas del FVIIa-PEGilado producido por este método.

Polytherics ha desarrollado otra estrategia para la PEGilación de proteínas y se conoce como TheraPEG en la cual se une un polímero de PEG a la proteína de interés mediante un enlace disulfuro reducido de un par de residuos de cisteína en la proteína (WO 25/7197). La técnica se ha utilizado para preparar una versión PEGilada del factor IX exento de contaminación procedente del factor FlXa (WO 29/1362).

Sin embargo, respecto a la utilización de esta misma tecnología para la PEGilación de FVIIa, no se ha considerado que sea sencilla o rutinaria.

1. Un conjugado factor FVIIapoMetMengMcol, donde uno o más grupos polietilenglicol están conjugados con FVIIa mediante un grupo conector que hace de puente entre los átomos de azufre de dos residuos de cisteína que formaban un enlace disulfuro en FVIIa, donde el conjugado tiene la estructura:

donde R1 es un sustituyente que es un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno C-i_ 1), o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoílo o naftilo; donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; donde la unión al polímero es por medio de un enlace hidroliticamente lábil o mediante un enlace no lábil.

2. Un conjugado factor FVIIa-polietilenglicol de la reivindicación 1, donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 5-1 kDa.

3. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado factor FVIIa-polietilenglicol tal como se reivindica en cualquier reivindicación anterior.

4. Una composición farmacéutica de la reivindicación 3 donde la composición comprende un portador, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptables.

5. Una composición farmacéutica tal como se reivindica en las reivindicaciones 3 o 4, que además comprende otro agente farmacéuticamente activo.

6. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que es adecuada para la administración parenteral.

7. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, que es adecuada para inyecciones intradérmicas, subcutáneas e intramusculares y para infusiones intravenosas o intraóseas.

8. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-7 en forma de una solución, suspensión o emulsión.

9. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, donde el conjugado de FVIIa tiene una semivida mayor en comparación con el FVIIa no modificado.

1. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde el conjugado de FVIIa tiene una AUC mayor en comparación con el FVIIa no modificado.

11. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-1, donde el conjugado de FVIIa tiene una biodisponibilidad mayor en comparación con el FVIIa no modificado.

12. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-1, donde el conjugado de FVIIa tiene una inmunogenicidad menor en comparación con el FVIIa no modificado.

13. Un conjugado factor FVIIa-polietilenglicol de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para utilizar en el tratamiento de una enfermedad de la coagulación sanguínea caracterizada por una pérdida de función de FVIIa o para utilizar en el tratamiento de un traumatismo.

14. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para utilizar en el tratamiento de una enfermedad de la coagulación sanguínea o traumatismo.

15. Un conjugado factor FVIIa-polietilenglicol para utilizar tal como se reivindica en la reivindicación 13 o la reivindicación 14 donde la enfermedad de coagulación sanguínea es hemofilia A o hemofilia B.

16. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de FVIIa de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para utilizar en la reducción del riesgo de hemartrosis, hemorragia, hemorragia gastrointestinal y menorragia en mamíferos con hemofilia A, hemofilia B o traumatismo.

17. La composición farmacéutica para utilizar en la reivindicación 16, donde la composición es para la administración subcutánea.

18. La composición farmacéutica para utilizar en la reivindicación 16, donde la composición es para la administración intravenosa.

19. La composición farmacéutica para utilizar en la reivindicación 16, donde la composición es para la administración

una vez cada uno-catorce días.

2. Un proceso para preparar el siguiente conjugado factor FVIla-polietilenglicol,

PEG

donde R1 es un sustituyente que es un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno Cmo) 1 o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoflo y naftilo; donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; donde la unión al polímero tiene lugar por medio de un enlace hidrolítlcamente lábil o por un enlace no lábil y donde el proceso comprende:

(a) la reducción de un enlace disulfuro natural entre dos residuos de cisteína en FVI la para generar dos grupos tiol libres;

(b) una primera de reacción de adición del tlolato entre un reactivo de conjugación que comprende un doble enlace conjugado y un grupo saliente;

(c) la eliminación del grupo saliente, para generar un doble enlace conjugado; y

(d) una segunda reacción de adición del tiolato, para formar un puente de 3 carbonos entre los dos átomos de azufre.

21. Un proceso tal como se reivindica en la reivindicación 2, donde el reactivo de conjugación tiene la fórmula

donde R1 es un sustituyente que es un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno Cmo) o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoílo y 25 naftilo; donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; donde la unión al polímero tiene lugar por medio de un enlace hidrolíticamente lábil o por un enlace no lábil y L es un grupo saliente.