Composiciones de tirosil-ARNt sintetasa angiogénicas y procedimientos.

Variante polipeptídica de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aislada,

que comprende:

(a) una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que incluye una hélice α5; y

(b) un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo que incluye una hélice α14;

en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos el 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº: 3), incluye por lo menos una sustitución no conservativa de residuos de aminoácidos de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la SEC ID nº: 3 y presenta una actividad angiogénica que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana.

Composiciones de tirosil-ARNt sintetasa angiogénicas y procedimientos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) angiogénicas. Más particularmente, esta invención se refiere a variantes de la proteína TyrRS angiogénicas y fragmentos angiogénicos de las mismas, y a su uso para la estimulación de la angiogénesis.

Antecedentes de la invención Las aminoacil-ARNt sintetasas son enzimas esenciales que catalizan la adición de aminoácidos a sus ARNt afines, como primera etapa en la síntesis de proteína. Estas enzimas esenciales están separadas en dos clases en base a la presencia de motivos de secuencia únicos y a la estructura global de sus dominios catalíticos. Las sintetasas de Clase I tienen dos motivos de aminoácidos muy conservados en los dominios catalíticos de sus diez miembros, por ejemplo, las secuencias HIGH (SEC ID nº : 1) y KMSKS (SEC ID nº : 2) . En contraste, las sintetasas de Clase II tienen tres motivos de secuencia muy degenerados, denominados motivos 1-3. Durante los últimos veinte años, varios roles adicionales para las ARNt sintetasas han sido descubiertos, incluyendo el splicing de ARN, la exportación nuclear y la regulación de la transcripción génica. Estas funciones adicionales han sido adquiridas durante la larga evolución de estas enzimas antiguas. Muchas de estas funciones adicionales son el resultado de dominios adjuntos que se han fusionado a las secuencias de sintetasa principales. En los eucariotas superiores, se ha demostrado que los dominios adjuntos de dos sintetasas tienen roles biológicos funcionales no relacionados con la función de la enzima principal. Por ejemplo, se ha demostrado que fragmentos de dos ARNt sintetasas humanas, por ejemplo, la tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) y la triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) , tienen actividades de tipo citoquina. Dos fragmentos relacionados de la TrpRS humana, conocidos como mini-TrpRS y T2-TrpRS, son reguladores negativos de la angiogénesis. La TyrRS humana (SEC ID nº : 3) puede separarse fácilmente en dos fragmentos activos. Un fragmento de dominio adjunto C-terminal tiene una actividad similar a la citoquina proinflamatoria polipéptido II activador del monocito endotelial (EMAP II) , mientras que un fragmento N-terminal (mini-TyrRS, residuos 1-364 de SEC ID nº : 3) induce la angiogénesis.

La angiogénesis es un proceso estrechamente regulado en el que debe mantenerse un meticuloso balance entre factores proangiogénicos y antiangiogénicos. La perturbación de este balance, que conlleva un excesivo o insuficiente crecimiento de vasos sanguíneos, está asociada con enfermedades como la degeneración macular relacionada con la edad, la artritis reumatoide, curación retardada de heridas, así como muchas otras condiciones. La regulación está controlada a través de una variedad de procesos que incluyen un control transcripcional y traduccional, modificaciones postraduccionales y procesamiento de ligando. Otras citoquinas proangiogénicas, incluyendo el factor alfa de necrosis tumoral y el factor de crecimiento de hepatocitos, se generan por división de proteínas precursoras. De forma similar, la división mediante proteasas libera fragmentos de citoquinas a partir de la TrpRS y la TyrRS humanas.

Las enzimas TrpRS y TyrRS de los eucariotas superiores están compuestas por una región central catalítica que incluye un plegamiento de Rossmann que tiene varias hélices alfa intercaladas en segmentos de hoja beta. El dominio catalítico de plegamiento de Rossmann de la TyrRS humana (residuos 1 a 230 de SEC ID nº : 3) incluye una fijación por puente de hidrógeno de la hélice α5 del dominio de plegamiento de Rossmann y la hélice α14 del dominio de reconocimiento de anticodón (ver Fig. 3, Panel Inferior, y Fig. 4 Panel Superior) . La fijación bloquea parcialmente el motivo Glu-Leu-Arg (ELR) en la hélice α5 del dominio de sitio activo de la proteína.

Los dominios catalíticos de la TyrRS y la TrpRS humanas son cada uno homólogos a los dominios catalíticos de sus respectivas enzimas bacterianas y de eucariotas inferiores correspondientes, adjuntos a una extensión C-terminal o N-terminal, respectivamente. La extensión C-terminal de la TyrRS humana comparte aproximadamente 51% de identidad de secuencia con la citoquina proinflamatoria EMAP II. En cada caso, las enzimas de longitud completa son inactivas como citoquinas pero funcionales como sintetasas. Cuando las extensiones únicas de eucariotas superiores se eliminan, las enzimas se vuelven citoquinas activas capaces de controlar la angiogénesis.

Actualmente, se ha descubierto que abriendo la separación entre la hélice α5 del dominio catalítico de plegamiento de Rossmann y la hélice α14 del dominio de reconocimiento de anticodón con respecto a la separación de estas hélices en la TyrRS humana nativa, se transforma la proteína en angiogénica. La presente invención se refiere a variantes de la proteína TyrRS y fragmentos de las mismas, que son útiles para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas de TyrRS biológicamente activas y fragmentos angiogénicos de las mismas (colectivamente denominados en la presente memoria “variantes polipeptídicas de TyrRS”) que son adecuados para estimular la angiogénesis en tejidos de mamífero. Las variantes polipeptídicas de

tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aisladas de la invención comprenden una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma; un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo; e incluyen por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la TyrRS humana (SEC ID nº : 3) . Las variantes presentan una actividad que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana nativa. Las variantes polipeptídicas de TyrRS de la invención tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 50% comparado con la secuencia de residuos de aminoácidos de la TyrRS humana (SEC ID nº : 3) , más preferentemente de por lo menos 80% de identidad de secuencia y aún más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia comparado con SEC ID nº : 3.

La región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma incluye una hélice α5, y el dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo incluye una hélice α14.

En una forma de realización, dicha por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana abre la separación entre la hélice α5y la hélice α14, con respecto a la separación de la hélice α5 y la hélice α14 en la TyrRS humana nativa. Preferentemente, la hélice α14 se separa de por lo menos 6 angstroms de la hélice α5 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α5. Preferentemente, la variante está libre de puentes de hidrógeno entre la hélice α5 y la hélice α14.

En otra forma de realización específica de la variante polipeptídica de TyrRS de la invención, la hélice α5 incluye un motivo ELR, y la hélice α14 está espaciada por lo menos 6 Ã?ngstrom del motivo ELR de la hélice α5 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α5. La variante presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la estructura terciaria del polipéptido.

En una forma de realización, dicha por lo menos una sustitución no conservativa de un residuo de aminoácido con respecto a la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana evita la formación de una fijación por puentes de hidrógeno entre el motivo ELR de la hélice α5 y los residuos de aminoácido de la hélice α14 de la variante polipeptídica de TyrRS que resulta en la exposición del motivo ELR en la estructura terciaria de la variante.

Una sustitución particularmente preferida es el reemplazo del aminoácido correspondiente a la tirosina en posición 341 de SEC ID nº : 3 por un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral alifática, preferentemente una cadena lateral alifática no polar, como un residuo de alanina.

Las variantes... [Seguir leyendo]

1. Variante polipeptídica de tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) aislada, que comprende:

(a) una región de plegamiento de Rossmann o una porción de la misma que incluye una hélice α5;

y

(b) un dominio de reconocimiento de anticodón o una porción del mismo que incluye una hélice α14;

en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos el 50% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº : 3) , incluye por lo menos una sustitución no conservativa de residuos de aminoácidos de un residuo de aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 46, 340 y 341 de la SEC ID nº : 3 y presenta una actividad

angiogénica que es mayor que la actividad angiogénica de la TyrRS humana.

2. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido no polar en la posición correspondiente al residuo 341 de la SEC ID nº : 3.

3. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa no polar en la posición correspondiente a la posición 46 de la SEC ID nº : 3.

4. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que incluye un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa no polar en la posición correspondiente a la posición 340 de la SEC ID nº : 3. 25

5. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 2, en la que la hélice α5 incluye un motivo ELR, cuyo motivo ELR está espaciado por lo menos aproximadamente 6 angstroms de la hélice α14 en la estructura terciaria de la variante, según lo determinado por la separación espacial entre el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido de la hélice α14 y el carbono alfa de cualquier residuo de aminoácido del motivo ELR de la hélice α5;

y en la que la variante presenta un motivo ELR expuesto en una porción externa de la estructura terciaria del polipéptido.

6. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 5, en la que el residuo de aminoácido no polar tiene una cadena lateral alifática. 35

7. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 5, en la que el residuo de aminoácido no polar se selecciona de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.

8. Variante polipeptídica de TyrRS según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la variante tiene una identidad de secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 80% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº : 3) .

9. Variante polipeptídica de TyrRS según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la variante tiene una identidad de 45 secuencia de residuos de aminoácido de por lo menos 95% en comparación con la secuencia de residuos de aminoácido de la TyrRS humana (SEC ID nº : 3) .

10. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de residuos de aminoácido de SEC ID nº : 4 o un fragmento de la misma, incluyendo por lo menos los residuos 1 a 364 de SEC ID

nº : 4, siendo el residuo X en la posición 341 de SEC ID nº : 4 seleccionado de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.

11. Variante polipeptídica de TyrRS según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de residuos de 55 aminoácidos de SEC ID nº : 4, siendo el residuo X en la posición 341 de SEC ID nº : 4 seleccionado de entre el grupo formado por un residuo de glicina, un residuo de alanina, un residuo de fenilalanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina y un residuo de prolina.

12. Variante polipeptídica de TyrRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la estimulación 60 de la angiogénesis en un tejido de un mamífero.

13. Variante polipeptídica de TyrRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el favorecimiento de la migración de células endoteliales en un tejido de un mamífero.