Composición de anticuerpos con alta ADCC.

Composición que comprende un anticuerpo monoclonal, caracterizada por que el anticuerpo posee en su sitio de glicosilación (Asn 297) del Fcγ

unas estructuras glicánicas seleccionadas de entre las formas:**Fórmula**

en la que el contenido en formas G0+G1+G0F+G1F es superior a 60% y el contenido en formas G0F+G1F es inferior a 50%.

Composición de anticuerpos con alta ADCC.

La presente invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo monoclonal, caracterizada por que el anticuerpo posee en su sitio de glicosilación (Asn 297) del Fcy unas estructuras glicánicas seleccionadas de entre las formas:

GOF,

GIF.

¡g GlcNAc

Mañosa Galactosa fe* Fucosa

en la que el contenido en formas G0+G1+G0F+G1F es superior a 60% y el contenido en formas G0F+G1F es inferior a 50%.

La presente descripción describe asimismo un procedimiento de obtención y de selección de anticuerpos monoclonales mediante un ensayo de tipo ADCC, pudiendo dichos anticuerpos activar los receptores Fcy de tipo III. La presente descripción da a conocer asimismo unos anticuerpos monoclonales que presentan una estructura glicánica particular, las células que producen dichos anticuerpos, los procedimientos de preparación de las células productoras, así como las composiciones farmacéuticas o los ensayos de diagnóstico que comprenden dichos anticuerpos.

Las composiciones de anticuerpos anti-D según la invención se pueden usar para la prevención de la ¡soinmunizadón Rhesus de individuos Rh negativos, en particular de la enfermedad hemolítica del recién nacido (MHNN) o en unas aplicaciones tal como la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI).

La inmunoterapia pasiva con la ayuda de anticuerpos policlonales se realiza desde los años 70. Sin embargo, la fabricación de las ¡nmunoglobulinas policlonales plantea varios problemas:

La inmunización de sujetos voluntarios se interrumpió en Francia en 1997, debido a los problemas éticos que presentan dichos actos. En Francia, tal como en Europa, el número de donantes inmunizados es tan bajo para asegurar un abastecimiento suficiente en ciertos anticuerpos, que es necesario importar plasma hiperinmunizado de los Estados Unidos por ejemplo.

Así, esta escasez de inmunoglobulina no permite prever una administración antenatal para la prevención de la MHNN.

Diversos estudios han conducido a la producción de anticuerpos monoclonales humanos con el objetivo de sustituir los anticuerpos policlonales obtenidos a partir del fraccionamiento de plasmas de donantes voluntarios.

Los anticuerpos monoclonales presentan varias ventajas: se pueden obtener en grandes cantidades a precios razonables, cada lote de anticuerpos es homogéneo y la calidad de los diferentes lotes es reproducible puesto que están producidos por la misma línea celular que es criopreservada en nitrógeno líquido. La seguridad del producto se puede asegurar en cuanto a la ausencia de contaminación vírica.

Varias publicaciones describen la obtención de líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh D de clase IgG, a partir de células B de donantes inmunizados. Boylston et al. 1980; Koskimies 1980; Crawford et al. 1983; Doyle et al. 1985; Goossens et al. 1987; Kumpel et al. 1989(a) y Me Cann-Carter et al. 1993 describen la obtención de líneas de linfocitos B transformados por el virus EBV. Melamed et al. 1985; Thompson et al. 1986 y Me Cann-Carter et al. 1993 se refieren a unos heterohíbridos que resultan de la fusión de linfocitos B (transformados por EBV) con mieloma murino. Goossens et al. 1987 se refiere a unos heterohíbridos que resultan de la fusión de linfocitos B (transformados por EBV) con mieloma humano. Bron et al. 1984 y Foung et al. 1987 describen unos heterohíbridos que resultan de la fusión de linfocitos B (transformados por EBV) con heteromieloma humano-ratón y, por último, Edelman et al. 1997 se refiere a unas células de insectos transfectadas con el gen que codifica para un anti-Rh(D) con la ayuda del sistema baculovirus.

Entre las patentes y solicitudes de patente que se refieren a dichos anticuerpos monoclonales y sus líneas secretoras, se pueden citar:

El documento EP 576 093 (AETS (FR), Biotest Pharma GmbH (Alemania); Composition for prophylaxls of the haemolytic disease of the new-born comprises two human monoclonal antibodies of sub-class lgG1 and lgG3, which are active agalnstthe Rhesus D antigen), el documento RU 2094462, WO 85/02413 (Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University, Human Monoclonal Antlbody agalnst Rh (D) Antigen and its Uses), el documento GB 86- 10106 (Central Blood Laboratories Authority, Productlon of heterohybridomas for manufacture of human monoclonal antibodies to Rhesus D antlgen), el documento EP 0 251 440 (Central Blood Laboratories Authority, Human Antl- Rhesus D Produclng Heterohybridomas), los documentos WO 89/02442, WO 89/02600 y WO 89/024443 (Central Blood Laboratories Authority, Human Anti-Rh (D) Monoclonal Antibodies), el documento WO 8607740 (Instituí Pasteur, Protein Performance SA, Paris, FR, Obtention dun anticorps monoclonal recombinant á partir d'un anticorps monoclonal human anti-rhésus D, sa production en cellules dinsecte et ses utilisations), el documento JP 88-50710 (International Reagents Corp., Japan, Reagents for Determinaron of Blood Group Substance Rh (D) Factor), el documento JP 83-248865 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan, Preparation of Monoclonal Antibody to Rh (D) positive Antigen), el documento CA 82-406033 (Queens University at Kingston, Human Monoclonal Antibodies) y el documento GB 8226513 (University College London, Human Monoclonal Antibody against Rhesus D Antlgen).

Si el uso de anticuerpos monoclonales presenta numerosas ventajas con relación al uso de pools de anticuerpos policlonales, puede en cambio resultar difícil obtener un anticuerpo monoclonal eficaz. En efecto, en el marco de la invención, se ha descubierto que el fragmento Fcy de la inmunoglobulina obtenida debe poseer unas propiedades bien particulares con el fin de poder interactuar y activar los receptores de las células efectoras (macrófago, linfocito T, H y NK).

La actividad biológica de ciertas inmunoglobulinas G es dependiente de la estructura de los oligosacáridos presentes en la molécula, y en particular en su parte Fe. Las moléculas IgG de todas las sub-clases humanas y murinas poseen un N-ollgosacárldo fijado al dominio CH2 de cada cadena pesada (en el residuo Asn 297 para las IgG humanas). Se ha demostrado la influencia de este residuo glicánico sobre la capacidad del anticuerpo para interactuar con unas moléculas efectoras (Fe receptores y complemento). La inhibición de glicosilación de una lgG1 humana, mediante el cultivo en presencia de Tunicamicina, provoca por ejemplo una disminución de 50 veces de la afinidad de este anticuerpo para el receptor FcyRI presente sobre los monocitos y macrófagos (Leatherbarrow et al., 1985). La fijación al receptor FcyRI11 está afectada asimismo por la pérdida de carbohidratos sobre la IgG, puesto que se ha descrito que una lgG3 no glicosilada es capaz de inducir una lisis de tipo ADCC por medio del receptor FcyRIlI de las células NK (Lund et al., 1990).

Sin embargo, más allá de la presencia necesaria de estos residuos glicánicos, es más precisamente la heterogeneidad de su estructura lo que puede ocasionar unas diferencias en la capacidad para activar unas funciones efectoras. Se han observado unos perfiles de galactosilación variables en función de los individuos (lgG1 humanas séricas). Estas diferencias reflejan probablemente unas disparidades en la actividad de las galactoslltransferasas y otras enzimas entre los clones celulares de estos individuos (Jefferis et al., 1990). Mientras que esta heterogeneidad normal de los procesos post-traduccionales genera diferentes glicoformas (incluso en el caso de anticuerpos monoclonales), puede conducir a unas estructuras atípicas asociadas a ciertos estados patológicos tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, para los cuales se ha demostrado una proporción Importante de los residuos agalactosllados (Parekh etal., 1985).

El perfil de glicosilación de la molécula purificada es la consecuencia de efectos múltiples de los que ya se han estudiado ciertos parámetros. El esqueleto proteico de las IgG y en particular los aminoácidos en contacto con los residuos N-acetilglucosamlna (GIcNAc) y galactosa terminales del brazo mañosa a 1-6 (aa 246 y 258 de las IgG) pueden explicar la existencia de estructuras preferenclales (galactosilación), tal como lo muestra el estudio realizado sobre las IgG murinas y quiméricas de diferentes isotlpos (Lund et al., 1993).

Las diferencias observadas demuestran asimismo unas especificidades relacionadas con la especie y con el tipo celular usado para la producción de la molécula. Así, la estructura habitual de los N-glicanos de las IgG humanas revela una proporción significativa de tipos biantenados con un residuo GIcNAc en posición bisectriz, estructura ausente a nivel de los anticuerpos producidos por... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende un anticuerpo monoclonal, caracterizada por que el anticuerpo posee en su sitio de glicosilación (Asn 297) del Fcy unas estructuras glicánicas seleccionadas de entre las formas:

en la que el contenido en formas G0+G1+G0F+G1F es superior a 60% y el contenido en formas G0F+G1F es inferior a 50%.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que el contenido en fucosa es inferior a 65%.

3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada por que el contenido en fucosa es inferior a 30%.

4. Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que el contenido en fucosa está comprendido entre 20% y 45% o también entre 25% y 40%.

5. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que el contenido en formas G0+G1+G0F+G1F es superior a 80%.

6. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el contenido en formas G0F+G1F es inferior a 30%.

7. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 6, estando el anticuerpo dirigido contra un antígeno dado, caracterizada por que activa las células efectoras que expresan el FcyRIII que provoca una lisis superior a 60% o 90% de la lisis provocada por unos anticuerpos policlonales dirigidos contra dicho antígeno.

8. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que el anticuerpo pertenece a la clase lgG1.

9. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que el anticuerpo pertenece a la clase lgG3.

10. Composición farmacéutica que comprende una composición según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de un medicamento.

12. Uso según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cánceres por inmunoterapia.

13. Uso según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de infecciones causadas por unos agentes patógenos víricos o bacterianos.

14. Uso de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 9, siendo dicho anticuerpo un anti-Rhesus(D), para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de manera profiláctica para la protección de mujeres Rhesus negativo, inmediatamente después del nacimiento de un hijo Rhesus positivo, para prevenir, cuando tienen lugar los embarazos ulteriores, la enfermedad hemolítica del recién nacido (MHNN), cuando tienen lugar abortos, embarazos extra uterinos en situación de incompatibilidad Rhesus D, cuando tienen lugar hemorragias transplacentarias que resultan de amniocentesis, de biopsias coriónicas, o de manipulaciones obstétricas traumatizantes en situación de incompatibilidad Rhesus D, en el caso de transfusiones Rh incompatibles con sangre o derivados sanguíneos lábiles y para et tratamiento de la Púrpura Trombocitopénica Idiopática (PTI).

GO,

H GicNAc

GOF,

Mañosa

G1 y GIF.

Galactosa o Fucosa