Anticuerpos IgG1 con la parte Fc mutada para el aumento de unión al receptor FcRn y usos de los mismos.

Una molécula de IgG1 que comprende un dominio Fc, un dominio CH3 o bisagra Fc derivada de la IgG1 humana que comprende Lys 433,

Phe 434 y Tyr 436, en donde la molécula de IgG1 es una Ig bivalente, una cadena sencilla de Ig, o una molécula de cadena pesada de IgG1 tal como una cadena pesada de longitud completa.

Anticuerpos lgG1 con la parte Fe mutada para el aumento de unión al receptor FcRn y usos de los mismos Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la inmunología y la biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a moléculas de Ig modificadas con características mejoradas.

2. Descripción de la técnica relacionada

La ¡nmunoglobulina G (IgG) constituye la clase de inmunoglobulina más prevalente en el suero del ser humano y de otros mamíferos. A pesar de las fluctuaciones en sus tasas de síntesis en los linfocitos B, las IgG se mantienen a niveles netamente constantes en el suero. SI se altera la homeostasls de la IgG, se puede producir entonces una patología debido a niveles demasiado altos (hlpergamaglobullnemla) o demasiado bajos (hipogamaglobullnemla). Los estudios Indican que el receptor relacionado con el complejo mayor de hlstocompatibilidad (MHC) clase I, FcRn, está implicado en la homeostasis de las IgG del suero (Ghetie y col, 1996; Junghans y Anderson, 1996; Israel y col, 1996). Este receptor actúa muy probablemente como receptor de recuperación, y sería coherente con su conocida capacidad para la transcitosis de IgG en forma intacta a través del intestino neonatal (Wallace y Rees, 198; Rodewald y Kraehenbuhl, 1984) y saco vitelino (Roberts y col, 199; Israel y col, 1995) o placenta (Kristoffersen y Matre, 1996; Simister y col, 1996; Leach y col, 1996; Firan y col, 21). Estudios más recientes indican que el FcRn también está implicado en el transporte de IgG a través de las barreras celulares epiteliales y endoteliales de origen diverso (Antohe y col, 21; McCarthy y col., 2; Spiekermann y col, 22; Dickinson y col, 1999; Kobayashi y col, 22; Yoshlda y col, 24), y esto tiene relevancia en el suministro de IgG a diferentes sitios del cuerpo. Por lo tanto, el uso de modificación proteica para modificar el sitio de interacción de una IgG con el FcRn ofrece una forma para modular la persistencia, distribución y transporte de ese anticuerpo en el suero.

Se han mapeado los sitios de interacción del FcRn en la lgG1 de ratón (mlgG1) y la lgG1 humana (hlgG1) utilizando mutagénesls dirigida al sitio de fragmentos Fe bisagra recombinantes, seguida por análisis de estos fragmentos tanto in vitro como in vivo (Kim y col, 1994b; Medesan y col, 1996; Medesan y col, 1997; Kim y col, 1999). A partir de estos estudios, la I253 (numeración EU (Edehnan y col, 1969)), H31, H435 y en menor grado, H436 (Y436 en hlgG1) tienen un papel crucial en esta interacción. Estos aminoácidos se localizan en la interfase del dominio CH2- CFI3 (Deisenhofer, 1981), y el mapeo del sitio funcional de estos restos es coherente con la estructura cristalográfica del FcRn de rata que forma un complejo con Fe de rata (Burmeister y col, 1994b; Martin y col, 21).

El sitio de interacción engloba tres bucles cerrados espacialmente compuestos por secuencias que están distales en la secuencia de aminoácidos primarla. El papel central de las histidinas Fe en la construcción de este sitio influye en la marcada dependencia del pH (unión a pH 6,, liberación a pH 7,2-7,4) de la interacción Fc-FcRn (Rodewald y Kraehenbuhl, 1984; Raghavan y col, 1995; Popov y col, 1996), de forma que la pKa de uno de los protones de imidazol reposa en este intervalo de pH. Esta dependencia del pH es esencial para la liberación de las moléculas de IgG unidas al FcRn cuando llegan a la superficie celular tras el reciclado o transcitosis celular (Ghetie y Ward, 2; Ober y col, 24a). Las I253, H31, H435 y en menor grado, H436, están altamente conservadas en las IgG humanas e IgG de roedores (Kabat y col, 1991). Esto, junto con el aislamiento de un homólogo humano de FcRn (Story y col, 1994), indican que los mecanismos moleculares Implicados en la homeostasls y el transporte de la IgG son comunes tanto en ratón como en el hombre y tienen sus implicaciones en la modulación de la farmacocinética, distribución y suministro de las IgG en los diferentes sitios del cuerpo.

En los estudios para identificar el sitio de Interacción de Fe con FcRn, se han llevado a cabo mutaciones de los fragmentos Fe (que comprenden el Fe y la reglón bisagra) que reducen las semlvldas en el suero de los fragmentos Fe correspondientes (Medesan y col, 1997; Kim y col, 1994a; Kim y col, 1999). Además, se han modificado los fragmentos Fe de IgG con afinidad aumentada por la unión con FcRn (Ghetie y col, 1997; Shlelds y col, 21; Hinton y col, 24) y estas moléculas tienen un aumento de persistencia en el suero de ratones (Ghetie y col, 1997) o monos Cynomolgus (Hinton y col, 24).

Los dominios Fe de inmunoglobulina también tienen gran interés con fines de estudio de los mecanismos de interacciones de anticuerpos con otras moléculas del sistema inmunitario. Estos incluyen, dependiendo de la clase de anticuerpo, interacciones con el complemento, y unión a receptores específicos de otras células, incluyendo los macrófagos, neutrófilos y mastocitos. Es importante un conocimiento más detallado de la biología de las regiones Fe para entender varios procesos moleculares del sistema inmunitario, tales como la fagocitosis, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y las reacciones alérgicas.

La producción de un fragmento Fe de vida más larga o de un anticuerpo que tenga un aumento de unión a los receptores Fe es atractiva, ya que tal fragmento o anticuerpo se puede utilizar, por ejemplo, para marcar reactivos terapéuticos. Esto permite dosis menores del agente que se va a utilizar en terapia y posiblemente permite incluso

dosis más bajas del agente que se va a utilizar gracias al aumento de su persistencia en la corriente sanguínea. Adicionalmente, tales moléculas pueden ser útiles, por sí mismas, para la terapia contra agentes patógenos, cáncer y enfermedades autoinmunes. También se prevé que tales anticuerpos se transportarán más eficazmente a través de la placenta durante el tercer trimestre de gestación ya que el FcRn es activo en el transporte materno-fetal de IgG (Simister, 23). Por lo tanto, se podrían suministrar anticuerpos protectores (por ejemplo, anti-patógenos) al feto en desarrollo.

Además, hay múltiples situaciones en las que sería deseable el aumento del aclaramiento de IgG de la circulación, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico en el que los anticuerpos autorreactivos producen una patología, y en situaciones en las que las toxinas o los fármacos se van a aclarar rápidamente del cuerpo utilizando un anticuerpo como agente aclarante. El aumento de aclaramiento de un anticuerpo se debería conseguir utilizando una molécula, tal como un anticuerpo modificado, que se une al FcRn con alta afinidad y no se disocia rápidamente a pH cercano a la neutralidad (a diferencia de los anticuerpo de origen natural). Tales anticuerpos no se liberarían de las células, sino que por el contrario se prevé que permanezcan unidos al FcRn y bloqueen la unión de otras IgG de afinidad menor. Como resultado, se bloquearía la función de FcRn, y las IgG endógenas o terapéuticas se dirigirían a la ruta lisosómica para la degradación (Ober y col., 24b). La dirección de tales anticuerpos `bloqueantes contra FcRn también puede ser útil para evitar el transporte de anticuerpos patógenos (por ejemplo, autorreactivos) de la madre al feto durante la gestación.

El documento WO 2/6919 trata de moléculas, incluyendo IgG, inmunoglobulinas no IgG, proteínas y agentes no proteicos, que tienen un aumento de la semivida in vivo debido a la presencia de un dominio constante de IgG, o una porción del mismo que se une a FcRn, que tiene una o más modificaciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del dominio constante o el fragmento para FcRn. Tales proteínas y moléculas con aumento de la semivida tienen la ventaja de que se necesitan en cantidades menores y/o dosificaciones menos frecuentes en el uso terapéutico, profiláctico o diagnóstico de tales moléculas.

Sumario de la invención

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una molécula de lgG1 que comprende un dominio Fe, un dominio CH3 o un dominio Fe bisagra derivado de lgG1 humana que comprende Lys433, Phe434 y Tyr436. La molécula de lgG1 puede comprender además uno o más de Tyr 252, Thr 254 y Glu 256, específicamente Tyr 252, Thr 254 o Glu 256, Tyr 252 y Thr 254, Tyr 252 y Glu 256, Thr 254 y Glu 256, o Tyr 252, Thr 254 y Glu 256. La molécula lgG1 es una Ig bivalente, una cadena sencilla de Ig, o una molécula de cadena pesada de lgG1, tal como una molécula de cadena pesada de longitud completa. La molécula de lgG1 puede unirse a un antígeno patógeno, tal como un virus, una bacteria, hongo,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de lgG1 que comprende un dominio Fe, un dominio CH3 o bisagra Fe derivada de la lgG1 humana que comprende Lys 433, Phe 434 y Tyr 436, en donde la molécula de lgG1 es una Ig bivalente, una cadena sencilla de Ig, o una molécula de cadena pesada de lgG1 tal como una cadena pesada de longitud completa.

2. La molécula de lgG1 de la reivindicación 1, comprendiendo además la molécula uno o más de Tyr 252, Thr 254 y Glu 256, la molécula comprende preferentemente además Tyr 252, Thr 254, o Glu 256; la molécula más preferentemente comprende además Tyr 252 y Thr 254, Tyr 252 y Glu 256, o Thr 254 y Glu 256; la molécula más preferentemente comprende además Tyr 252, Thr 254 y Glu 256.

3. Un fragmento de la molécula de IgG de la reivindicación 1, en donde dicho fragmento es el dominio Fe de una lgG1 humana que comprende Lys 433, Phe 434 y Tyr 436.

4. La molécula de IgG de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de lgG1 se une a un agente patógeno tal como un virus, bacteria, parásito u hongo; o en donde dicha molécula de lgG1 se une a una toxina, un anticuerpo autoinmune, o un anticuerpo anti-trasplante.

5. Una composición farmacéutica que comprende una molécula lgG1 de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o el fragmento de la reivindicación 3 y un tampón, vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha molécula de lgG1 o fragmento es terapéutico o profiláctico para un trastorno autoinmune o infección por un agente patógeno.

7. La molécula de lgG1 de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o el fragmento de la reivindicación 3 para su uso en

(a) el aumento de las tasas de aclaramiento en un sujeto que padece de anticuerpos patógenos o que se trata con un anticuerpo para aclarar un fármaco tóxico del cuerpo; o

(b) el bloqueo de la función de FcRn en un sujeto que padece de autoinmunidad o que está expuesto a una transferencia de anticuerpos patógenos de la madre al hijo.

8. La molécula de lgG1 de la reivindicación 1 que se conjuga con un agente terapéutico o diagnóstico.

9. La molécula de lgG1 de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho agente terapéutico es un antibacteriano, antivírico o antitoxina, o en donde dicho agente diagnóstico es un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, o un cromóforo.

1. Una proteína quimérica que comprende una molécula de lgG1 de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o el fragmento de la reivindicación 3.

11. La molécula de lgG1 de la reivindicación 1 para su uso como un medicamento, en donde la molécula de lgG1 se suministra por medio de un epitelio que expresa FcRn.

12. La molécula de lgG1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el epitelio es epitelio intestinal, bronquial o pulmonar.