Anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/anti-ANG-2.

Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y la angiopoyetina-2 humana (ANG-2),

que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente al VEGF humano y un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a la ANG-2 humana, en el que i) dichos sitios de unión a antígeno son cada uno de ellos un par de dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dominio variable de cadena ligera de anticuerpo; ii) dicho primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente al VEGF comprende en el dominio variable de la cadena pesada, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 1, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 2, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 3, y en el dominio variable de la cadena ligera, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 4, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 5, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 6; iii) dicho segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende en el dominio variable de la cadena de de cadena pesada, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 46, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 47, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 48, y en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 49, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 50, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 51; y iv) dicho anticuerpo es bivalente.

Anticuerpos biespecíficos anti-VEGF/ anti-ANG-2

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF / VEGF-A) y contra la angiopoyetina-2 humana (Ang-2) , los métodos para su producción, las composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, y las utilizaciones de los mismos.

Antecedentes de la invención La angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos, lo que incluye los tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como las retinopatías proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , la artritis reumatoide y la psoriasis (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu Rev. Physiol 53 (1991) 217-239; y Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., y Klintworth, GK (Ed.) , 2 ª edición, Marcel Dekker, Nueva York (1994) , págs. 1625-1710) . En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. De acuerdo con ello, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en las secciones de tumor y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama, así como en varios tumores distintos (Weidner, N., et al, N Engl J Med. 324 (1991) 1-8; Horak, ER, et al, Lancet 340 (1992) 1120-1124; Macchiarini y, P., et al, Lancet 340 (1992) 145-146) .

VEGF y anticuerpos anti-VEGF

El factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/ VEGF-A) (Id. De sec. Nº: 105) se describe en, por ejemplo Leung, DW, et al, Science 246 (1989) 1306-9; Keck, PJ et al., Science 246 (1989) 1309-1312 y Connolly, DT, et al, J. Biol. Chem 264 (1989) 20017-24. El VEGF está implicado en la regulación de la angiogénesis y la neovascularización normal y anormal asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara, N., et al, Endocr Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, RA, et al, J Clin Invest 91 (1993) 153-159; Brown, LF, et al, Pathol humano 26 (1995) 86-91; Brown, LF, et al, Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J, et al, Brit. J. Cancer 73 (1996) 931-934; y Dvorak, H., et al, Am. J. Pathol 146 (1995) 1029-1039) . El VEGF es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado de varias fuentes. El VEGF muestra una actividad mitógena altamente específica de las células endoteliales. El VEGF tiene importantes funciones reguladoras en la formación de nuevos vasos sanguíneos durante la vasculogénesis embrionaria y en la angiogénesis durante la vida adulta (Carmeliet, P., et al, Nature, 380 (1996) 435439; Ferrara, N., et al, Nature, 380 (1996) 439-442; revisado en Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18 (1997) 4

25. La importancia del papel que desempeña el VEGF se ha demostrado en estudios que muestran que la inactivación de un solo alelo de VEGF resulta en letalidad embrionaria debido a un fallo de desarrollo de la vasculatura (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442. Además, el VEGF tiene una fuerte actividad quimiotáctica hacia los monocitos, puede inducir el activador del plasminógeno y el inhibidor del activador del plasminógeno en las células endoteliales, y también puede inducir la permeabilidad microvascular. Debido a esta última actividad, en ocasiones se le conoce como factor de permeabilidad vascular (VPF) . El aislamiento y las propiedades del VEGF se han revisado, véase Ferrara, N., et al,

J. Cellular Biochem, 47 (1991) 211-218 y Connolly, J. Cellular Biochem, 47 (1991) 219-223. El corte y empalme alternativo del mRNA de un sólo gen de VEGF da lugar a cinco isoformas de VEGF.

Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas celulares de tumores humanos en ratones (Kim, I., et al., Nature 362 (1993) 841-844; Warren, SR, et al, J. Clin Invest. 95 (1995) 17891797; Borgstrom, P., et al, Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039; y Melnyk, O., et al, Cancer Res. 56 (1996) 921-924) . Las patentes WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 y WO 00/35956 se refieren a anticuerpos contra el VEGF. El anticuerpo monoclonal humanizado bevacizumab (vendido bajo el nombre comercial Avastin®) es un anticuerpo anti-VEGF utilizado en la terapia tumoral (WO 98/45331) .

El ranibizumab (nombre comercial Lucentis®) es un fragmento de anticuerpo monoclonal derivado del mismo anticuerpo murino parental que el bevacizumab (Avastin) . Es mucho más pequeño que la molécula original y se ha madurado por afinidad para proporcionar una unión más fuerte al VEGF-A (WO 98/45331) . Es un antiangiogénico que se ha aprobado para el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) de tipo "húmedo", una forma común de pérdida de visión relacionada con la edad. Otro anticuerpo anti-VEGF es, por ejemplo, el HuMab G6-31 que se describe, por ejemplo, en la patente US 2007/0141065.

ANG-2 y anticuerpos anti-ANG-2

La angiopoyetina-2 humana (Ang-2) (abreviada alternativamente con ANGPT2 o ANG2) (Id. de sec. Nº: 106) se describe en Maisonpierre, PC, et al, Science 277 (1997) 55-60 y Cheung, AH, et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 y -2 (ANG-1 (Id. de sec. Nº: 107) y Ang-2 (Id. de sec. Nº: 106) ) se descubrieron como ligandos para las Tie, una familia de quinasas de tirosina que se expresa selectivamente en el endotelio vascular

(Yancopoulos, GD, et al., Nature 407 (2000) 242-48) . En la actualidad existen cuatro miembros definitivos de la familia de angiopoyetinas. La angiopoyetina-3 y -4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar homólogos ampliamente divergentes de un mismo locus génico en ratón y el hombre (Kim, I., et al, FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al, J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-28) . Ang-1 y Ang-2 se identificaron originalmente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (véase, para ANG-1: Davis, S., et al, Cell 87 (1996) 11611169, y de ANG-2: Maisonpierre, PC, et al, Science 277 (1997) 55-60) . Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como -2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd) (Maisonpierre, PC, y col., Science 277 (1997) 55-60. Se demostró que ANG-1 apoya la supervivencia de las CE y promueve la integridad del endotelio, Davis, S., et al, Cell 87 (1996) 1161-1169; Kwak, HJ, et al, FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., et al, Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al, Science 286 (1999) 251 1-14; Thurston, G., et al, Nat. Med. 6 (2000) 460-63, mientras que Ang-2 poseía el efecto opuesto y promueve la desestabilización y la regresión de los vasos sanguíneos en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o factor de crecimiento de fibroblastos básico (Maisonpierre, PC, y col., Science 277 (1997) 55-60. Sin embargo, muchos estudios de la función de ANG-2 han sugerido una situación más compleja. ANG-2 podría ser un regulador complejo del remodelado vascular que juega un papel tanto en la aparición de los vasos como en su regresión. Apoyando estos papeles de Ang-2, el análisis de su expresión revela que Ang-2 se induce rápidamente, junto con el VEGF, en el contexto de un adulto de aparición angiogénica, mientras que Ang-2 se induce en ausencia de VEGF en el contexto de la regresión vascular (Holash, J., et al, Science 284 (1999) 1994-1998; Holash, J., et al, Oncogene 18 (1999) 5356-62) . De forma consistente con un papel dependiente del contexto, Ang-2 se une específicamente al mismo receptor específico del endotelio, Tie-2, que es activado por Ang-1, pero tiene efectos dependientes del contexto en su activación (Maisonpierre, PC, y col., Science 277 (1997) 55-60) .

Los ensayos de angiogénesis de la córnea han demostrado que tanto ANG-1 y ANG-2 tuvieron efectos similares, actuando de forma sinérgica con el VEGF para promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Asahara, T., et al., Circ. Res.. 83 (1998) 233-40. La posibilidad de que hubiera una respuesta endotelial dependiente de la dosis aumentó con la observación de que in vitro y a alta concentración, ANG-2 también puede ser proangiogénico. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52. En altas concentraciones, ANG-2 actúa como un factor de supervivencia a la apoptosis en las células endoteliales durante la apoptosis por privación de suero mediante la activación de Tie2 a través de las vías de la PI-3 quinasa y Akt. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52.

Otros experimentos in vitro sugirieron que durante la exposición sostenida, los efectos de ANG-2 pueden cambiar progresivamente de un antagonista a un agonista de Tie2, y en posteriormente, puede contribuir directamente a la formación del tubo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) , que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente al VEGF humano y un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a la ANG-2 humana, en el que i) dichos sitios de unión a antígeno son cada uno de ellos un par de dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y dominio variable de cadena ligera de anticuerpo; ii) dicho primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente al VEGF comprende en el dominio variable de la cadena pesada, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 1, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 2, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 3, y en el dominio variable de la cadena ligera, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 4, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 5, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 6; iii) dicho segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende en el dominio variable de la cadena de de cadena pesada, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 46, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 47, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 48, y en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR3 de Id. de Sec. Nº 49, una región CDR2 de Id. de Sec. Nº 50, y una región CDR1 de Id. de Sec. Nº 51; y iv) dicho anticuerpo es bivalente.

2. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque la relación de las afinidades de unión Kd del sitio de unión al altígeno específico para VEGF/ Kd del sitio de unión a antígeno específico para ANG-2 es de 1, 0 a 10, 0.

3. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2, que se caracteriza porque el segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a la ANG-2 humana no se une específicamente a la angiopoyetina humana 1 (ANG-1) .

4. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento del cáncer.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares.

7. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 para su uso en el tratamiento del cáncer.

8. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 para su utilización en el tratamiento de enfermedades vasculares.

9. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.

10. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 capaz de expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped procariota o eucariota.

11. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un método para la producción de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado por expresar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 en una célula huésped procariota o eucariota y la recuperación de dicho anticuerpo biespecífico a partir de dicha célula o del sobrenadante de su cultivo celular.

Figura 1A Figura 1B Figura 2A Figura 2-parte uno

Antígeno

Fragmento de anticuerpo de

longitud completa que se une al

antígeno A

Enlazante peptídico entre ambos

fragmentos (Ac de longitud

completa y ds-scFv)

Enlazante de

cadena sencilla Fragmentos de ds-scFv que se une al antígeno B

Antígeno Puente disulfuro

opcional para

estabilizar

Figur.

2. parte dos origen pUC

Repetición 72 pb Gen de resistencia a ampicilina Repetición 72 pb acortada RB15 cadena ligera G6-31

Región potenciadora 7273 pb

caja TATA Inicio de transcripción Figura 3

No reducido Reducido Figura 4A

1. Conjunto de proteína A G6-31: 10% de agregados Figura 4B

1. Conjunto de SEC, tras purificación G6-31: >99% monómero TVAb6: >99% monómero Figura 4C

3. Conjunto de SEC, tras 24h a 4ºC G6-31 : >99% monómero TVAb 6: >99% mo nómero Figura 5-parte uno ELISA de unión a VEGF

Figura 5-parte dos Figura 6A

ELISA de unión a Ang-2

Figura 6B

Unión de hAng-2 a <Ang-2> Mab536

(Modelo de unión de Langmuir 1:1)

Tiempo

Unión de hAng-2 a <VEGF-Ang-2> TvAb6

Tiempo Flujo <hIgG-Fcy> de cabra Superficie del chip (CM5)

Figura 7 parte uno ELISA de puente de VEGF-Ang-2

Figura 7 parte dos Figura 8AFigura 8BFigura 9

Figura 10A

Puntos de ramificación Sin tratar

Figura 10BFigura 11 Figura 12

Figura 13

Capturar 1. Inyectar TvAb 2. Inyectar hVEGF (R&D) hAng-2-His

Regeneración Chip CM5

Figura 14 Figura 15A Figura 15BFigura 16A Figura 16B

Figura 17

Ac antagonista placa Figura 18

M

ñ

D

x

ò

c

ó

n

[1

]

Figura 19