Anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral.

Un anticuerpo contra Dlk-1, humano, donde la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID Nº 67 o 68 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº 71.

Anticuerpos antihumanos frente a DLK-1 que tienen actividad antitumoral

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral y, en particular, a anticuerpos anticuerpos antihumanos frente a Dlk-1 que tienen actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención también se refiere a hibridomas que producen los anticuerpos mencionados anteriormente y a un uso de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Antecedentes de la invención El Dlk-1 (homólogo 1 similar a delta (Drosophila) ) humano, que en lo sucesivo se puede denominar "hDlk-1") es una proteína transmembrana de tipo 1 (tipo transmembrana uno) con una longitud completa de 383 residuos de aminoácidos que tiene 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. La región extracelular muestra homología con una familia Notch/Delta/Serrate. Se ha clonado un gen hDlk-1 como molécula expresada en una línea celular derivada de carcinoma microcítico de pulmón respondedor a GRP (péptido liberador de gastrina) (documento no patente 1) o como factor para suprimir la diferenciación preadipocitos (documento no patente 2) . Desde el punto de vista de la homología de la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 con la de delta que es un ligando de un receptor nocht como regulador de la diferenciación celular, dicho Dlk-1 generalmente es un símbolo génico, DLK1. También tiene otros diversos símbolos génicos tales como Pref-1 (documento no patente 2) , pG2 (documento no patente 3) , SCP-1 (documento no patente 4) y ZOG (documento no patente 5) . No obstante, estos símbolos génicos básicamente indican la misma molécula.

Además, hDlk-1 se escinde con una proteasa sin identificar que corta las proximidades de la membrana celular en la región extracelular de hDlk-l y después se secreta en la sangre. El hDlk-1 libre (región extracelular de hDlk-1) es una molécula idéntica a una glicoproteína denominada FA-1 (antígeno fetal 1) (documento no patente 6) que consiste en 225 a 262 residuos de aminoácidos.

El gen de hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan a un nivel alto en células fetales no diferenciadas y altamente proliferativas. En particular, el gen de hDlk-1 y el producto génico del mismo se expresan altamente en hígado fetal, riñón fetal, músculo esquelético fetal, cerebro fetal y similares. No obstante en el nacimiento, la expresión de dicho gen de hDlk-1 y un producto génico del mismo no se puede observar en la mayoría de los tejidos. En tejidos adultos normales, el gen de hDlk-1 y el producto génico del mismo se localizan en la glándula suprarrenal, la placenta y la hipófisis (documento patente 1, documento no patente 2) .

Adicionalmente, incluso en tejidos maduros, se observa expresión de hDlk-1 en células que se consideran células madre indiferenciadas o células precursoras. Por ejemplo, se ha notificado que la expresión de hDlk-1 se ha observado en células ovales hepáticas que están indiferenciadas y son pluripotenciales en hígados adultos (documentos no patente 7 y 8) o en células madre mesenquimatosas que son las células madre de células óseas/cartilaginosas/adiposas (documento no patente 9) . Se ha sugerido que hDlk-1 está asociado con las propiedades de dichas células madre tisulares, tal como el mantenimiento de la capacidad de indiferenciación.

Dicho patrón de expresión de hDlk-1 restringida en las células fetales o las células madre y una familia de genes/productos génicos que tienen motivos de tipo EGF (receptor Notch, ligando de Notch (delta, Jagged, serrate) , etc.) generalmente controla el crecimiento o diferenciación de las células mediante interacción intercelular mediante motivos de tipo EGF. Por tanto, se ha sugerido que hDlk-1 también tiene dichas funciones. De hecho, se ha sabido bien que la expresión de hDlk-1 disminuye de forma concomitante con la diferenciación de las células precursoras adiposas y que la diferenciación adiposa se suprime, si se fuerza la expresión del gen de hDlk-1 en las células precursoras adiposas (documento no patente 2) . No obstante, en la actualidad, los detalles sobre una molécula (un ligando) que interacciona con hDlk-1.

Por otro lado, se ha notificado que el gen de hDlk-1 y el producto génico del mismo se expresan con una frecuencia elevada de varios tipos de cánceres o tumores. Los tipos de cáncer en los que hasta ahora se ha confirmado la expresión de hDlk-1 incluyen: cánceres sólidos tales como tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis de tipo 1, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de hígado, cáncer renal y cáncer de ovarios (documentos patente 1 y 2 y documentos no patente 1, 3, 10, 11, 12, 13 y 14) y cánceres de sangre tales como síndrome mielodisplásico (documento patente 3 y documentos no patente 15 y 16) y leucemia mielocítica aguda (documento no patente 16) . Se ha notificado que el crecimiento celular se acelera si se introduce un gen de hDlk-1 en una célula K5 62 que es una línea celular de eritroleucemia (documento no patente 16) y también que, si dicho gen de hDlk-1 se introduce en glioblastomas, produce la desaparición de la inhibición por contacto de las células, así como la aceleración del crecimiento celular, de modo que se puede lograr una capacidad de crecimiento celular independiente del anclaje. Se ha sugerido la relación entre hDlk-1 y carcinogénesis (documento no patente 17) .

El documento WO 2005/052156 divulga métodos de detección de cáncer hepático, un diagnóstico de cáncer hepático y un remedio para el cáncer.

<Documentos patente>

Documento de patente 1: WO 2005/052156

Documento de patente 2: WO 02/081625

Documento de patente 3: Publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público Nº 2001 -269174

<Documentos no patente>

Documento no patente 1: Laborda, J. et al., J. Biol. Chem., vol. 268 (6) , pp. 3817-3820 (1993)

Documento no patente 2: Smas, C. M. et al., Cell, vol. 73 (4) , pp.725-734 (1993)

Documento no patente 3: Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp. 2336-2339 (1987)

Documento no patente 4: Maruyama, K. et al., No publicado, número de acceso en Genebank D16847 (1993)

Documento no patente 5: Halder, S. K. et al., Endocrinology, vol. 139, pp. 3316-3328 (1998)

Documento no patente 6: Fay, T. N. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 29, pp. 73-85 (1988)

Documento no patente 7: Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol. 5, pp. 209-218 (2004)

Documento no patente 8: Jensen, CH. et al., Am. J. Pathol., vol. 164 (4) , pp.1347-1359 (2004)

Documento no patente 9: Abdallah, B. M. et al., J. Bone Miner. Res., vol. 19 (5) , pp. 841-852 (2004)

Documento no patente 10: Jensen, C. H. et al., Br. J. Dermatol., vol. 140 (6) , pp. 1054-1059 (1999)

Documento no patente 11: Jensen, C. H. et al., Tumour Biol., vol. 20 (5) , pp. 256-262 (1999)

Documento no patente 12: Yin, D. et al., Int. J. Oncol., vol. 24 (4) , pp. 1011-1015 (2004)

Documento no patente 13: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13) , pp. 1852-1861 (2006)

Documento no patente 14: Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., vol. 58, pp. 145-150 (2006)

Documento no patente 15: Miyazato, A. et al., Blood, vol. 98, pp. 422-427 (2001)

Documento no patente 16: Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol. 19 (8) , pp. 1404-1410 (2005)

Documento no patente 17: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13) , pp. 1852-1861 (2006)

Sumario de la invención Como se ha descrito anteriormente, en el caso de los tejidos normales, la expresión de hDlk-1 está restringida en las células embrionarias o células madre. No obstante, en el caso de los tejidos de cáncer, hDlk-1 se expresa con una frecuencia elevada en varios tipo de células. Dicho hDlk-1 es una proteína de membrana celular/proteína secretora. En base a estos hechos, se considera que hDlk-1 es una buena diana en el tratamiento de varios tipos de tumores, etc. Cuando este hDlk-1 es la diana, un anticuerpo anti-hDlk-1 se considera útil.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-hDlk-1 que tiene actividad antitumoral, específicamente un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 que tiene actividad antitumoral in vivo y, particularmente, el anticuerpo mencionado anteriormente, que es un anticuerpo humanizado. Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un complejo del anticuerpo mencionado anteriormente y un agente, una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, un método para detectar un tumor y un kit para detectar o diagnosticar un tumor.

Los presentes inventores han realizado... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo contra Dlk-1, humano, donde la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID Nº 67 o 68 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID Nº 71.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que tiene actividad antitumoral in vivo.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, donde la actividad antitumoral es una actividad de inhibición de la angiogénesis tumoral.

5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el tumor es al menos de un tipo seleccionado del grupo que consiste en cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de pulmón microcítico y neuroblastoma humano.

6. Un fragmento del anticuerpo contra Dlk-1 humano definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el fragmento comprende la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H mostrada en las SEC ID Nº 67 o 68 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L mostrada en la SEC ID Nº 71.

7. Un complejo anticuerpo – agente que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un compuesto que tiene una actividad antitumoral y/o una actividad de destrucción celular.

8. Un complejo fragmento de anticuerpo – agente que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 y un compuesto que tiene una actividad antitumoral y/o una actividad de destrucción celular.

9. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o el complejo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso en el tratamiento de un tumor

o en la inhibición de una angiogénesis tumoral.

10. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o el complejo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para su uso en el diagnóstico o detección in vivo de un tumor.

11. Un método in vitro para diagnosticar o detectar un tumor usando el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o el complejo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

12. El método de la reivindicación 11, que comprende: permitir que al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo

o complejo reaccione con una muestra recolectada de un cuerpo vivo y detectar una o más señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que ha reaccionado.

13. Un método para inhibir una angiogénesis tumoral in vitro que comprende tratar un tumor con el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o el complejo del mismo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

14. Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor o la inhibición de una angiogénesis tumoral, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.