Anticuerpos anti-HER4 específicos de isoforma.

Un anticuerpo anti-HER4 aislado que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4,

anticuerpo que no tiene reactividad cruzada significativa con la isoforma JM-b de HER4, en donde el anticuerpo compite para unirse a la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655.

Anticuerpos anti-HER4 específicos de isoforma Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos útiles para detectar y tratar cáncer y a procedimientos de uso de aquellos anticuerpos.

Antecedentes de la invención Los receptores ErbB/HER forman una subfamilia de tirosina cinasas de receptor que incluye EGFR (también conocido como ErbB1 o HER1) , HER2 (c-Ncu, ErbB2) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4) . Los receptores ErbB son activados selectivamente por varios factores de crecimiento similares a EGF que conducen a respuestas celulares, tales como proliferación, diferenciación, migración o supervivencia celular. Los receptores ErbB consisten en un dominio extracelular glucosilado, un único dominio transmembrana y un dominio intracelular que incluye una enzima tirosina cinasa. La unión del ligando al dominio extracelular del receptor produce la dimerización del receptor, posterior activación del dominio de cinasa, autofosforilación del receptor y múltiples cascadas de señalización aguas abajo (1) .

EGFR y HER2 son oncogenes bien establecidos y dianas de fármaco para el cáncer. Participan en la patogénesis de diversos tumores malignos epiteliales y neurales, y su actividad en exceso está asociada a mal desenlace del paciente (2-4) . Los terapéuticos elegidos como diana que incluyen tanto anticuerpos monoclonales como inhibidores de cinasas de peso molecular pequeño que bloquean las funciones de estos receptores han mostrado efecto terapéutico sobre la supervivencia del paciente en ensayos clínicos. Cetuximab (ERBITUX™, Imclone, Inc.) es un anticuerpo monoclonal quimérico que bloquea la unión del ligando a EGFR, conduciendo a una disminución en la dimerización del receptor, autofosforilación y activación de rutas de señalización (5) . Cetuximab está actualmente autorizado para uso clínico en cáncer colorrectal quimiorresistente en estadio tardío y carcinoma de células escamosas localmente o regionalmente avanzado de la cabeza y el cuello. Trastuzumab (HERCEPTIN™, Genentech, Inc.) es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el dominio extracelular de HER2 actualmente usado para el tratamiento de cánceres de mama que expresan en exceso ErbB2 en tanto entorno adyuvante como para enfermedad avanzada (6-9) .

Se ha mostrado que los antagonistas de receptores de HER4 son útiles en controlar la excesiva migración y/o proliferación de células de músculo liso y, en particular, para el tratamiento de estenosis. Véase la patente de Estados Unidos nº 7.332.579.

La significancia de HER4 en cáncer es poco entendida. Algunas observaciones indican que el receptor HER4 se regula por disminución en diversos cánceres, o que su expresión está asociada a marcadores de pronóstico favorables, tales como la expresión de receptores de estrógenos (10, 11) . Por otra parte, se ha informado que HER4 tiene altos niveles de expresión en varios cánceres tales como cáncer de tiroides (12) , de ovario (13) y de mama (14) , además de meduloblastoma (15) y ependimoma (16) . Además, la significancia de los niveles de expresión de HER4 para el desenlace clínico está en conflicto (17) . Una de las explicaciones plausibles para estos datos contradictorios es que se generan cuatro isoformas estructuralmente y funcionalmente diferentes a partir de un gen HER4 por corte y empalme alternativo (18, 19) . Estas isoformas tienen diferentes perfiles de distribución en tejido y se diferencian en su capacidad para promover la tumorigénesis en líneas de células de cáncer de mama (26) .

Por consiguiente, se desea proporcionar un terapéutico que se refiera a isoformas específicas del receptor HER4 para tratar más trastornos mediados por HER4.

Resumen de la invención Un aspecto de la invención proporciona un anticuerpo anti-HER4 aislado que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER4, en el que el anticuerpo compite para unirse a la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 el mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655. En otra realización, el anticuerpo se une al mismo epítope que el epítope al que se une el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.

En otra realización, el anticuerpo anti-HER4 aislado que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4 comprende un fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655 que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4. En una realización, el fragmento comprende la región variable de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal mAb 1479. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo está madurado por afinidad. En una realización, el anticuerpo anti-HER4 aislado comprende el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC

que tiene nº de acceso PTA-9655 o forma humanizada del mismo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-HER4 aislado está ligado a un agente citotóxico.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-HER4 aislado que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4 tiene menos cardiotoxicidad que un anticuerpo anti-HER4 que no es específico para la isoforma JM-a de HER-4.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento de inhibición de la proliferación de una célula cancerosa que expresa la isoforma JM-a de HER-4, que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-HER4 que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4. En una realización, el anticuerpo anti-HER4 reduce la diseminación del ectodominio de HER4. En algunas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de cáncer de mama, cáncer de ovario o meduloblastoma.

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer en un paciente cuyo cáncer expresa la isoforma JM-a de HER-4 que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-HER4 que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4.

El cáncer que va a tratarse es cáncer de mama.

El procedimiento puede comprender seleccionar un paciente cuyas células cancerosas expresan la isoforma JM-a de HER-4 y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-HER4 como se reivindica que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4. En una realización, el anticuerpo anti-HER4 reduce HER4 la diseminación del ectodominio.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento de detección de la presencia del ectodominio de HER4 diseminado en una muestra de células que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER4 como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un diagrama que muestra las isoformas de HER4 del dominio yuxtamembrana alternativo JM-a (SEC ID Nº : 1) y JM-b (SEC ID Nº : 2) .

La Figura 2 es una tabla que describe características de ciertos anticuerpos monoclonales para HER4.

La Figura 3 es un análisis de transferencia Western que representa la especificidad de unión del mAb 1479 y un anticuerpo de control, sc-283, por células COS-7 que expresan las isoformas de HER4 JM-a CYT-2 o JM-b CYT-1.

La Figura 4 es un análisis de transferencia Western que representa la especificidad de unión del mAb 1479 y anticuerpos de control anti-EGFR (sc-03) , anti-HER2 (sc-284) , anti-HER3 (sc-285) por células NIH 3T3-7d y NR6 que expresan establemente diferentes receptores ErbB.

La Figura 5 es una gráfica que muestra la especificidad de unión del mAb 1479 por transfectantes NIH 3T3-7d y NR6 que expresan HER4 JM-a CYT-2, HER4 JM-b CYT-1, EGFR, HER2 o HER3 como se analiza por una enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) celular (columnas grises) . Se comparó la unión del mAb 1479 a la unión de anti-EGFR (sc-03) , anti-HER2 (sc-284) , anti-HER3 (sc-285) y anti-HER4 (sc-283) (unión de todos los anticuerpos de control en columnas blancas) en diluciones 1:1000 (izquierda) o 1:100 (derecha) .

La Figura 6 es un análisis de transferencia Western que muestra la unión del mAb 1479 al ectodominio de HER4 diseminado en lisado de tejido de riñón humano y al ectodominio de HER4 recombinante.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro llevado a cabo con un ectodominio... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-HER4 aislado que se une específicamente a la isoforma JM-a de HER-4, anticuerpo que no tiene reactividad cruzada significativa con la isoforma JM-b de HER4, en donde el anticuerpo compite para unirse a la isoforma JM-a con el anticuerpo anti-HER4 mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une al mismo epítope que el epítope al que se une el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº 10 de acceso PTA-9655.

3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende un fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655, en donde el fragmento comprende las tres regiones hipervariables VH1, VH2 y VH3 y las tres regiones hipervariables VL1, VL2, y VL3 del mAb 1479.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el fragmento del anticuerpo monoclonal mAb 1479 comprende las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del mAb 1479.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grado de reactividad cruzada con HER4 JM-b es inferior al

a) 10% b) 5 % 25 c) 2%, o d) 1 %

como se determina por análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) . 30

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo se une a la isoforma JM-a de HER-4 con afinidad representada por una Kd de 10-8 M, o con mayor afinidad.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo 35 quimérico, humano o humanizado.

8. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal mAb 1479 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC que tiene nº de acceso PTA-9655 o forma humanizada del mismo.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo está ligado a un agente citotóxico.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo tiene menos cardiotoxicidad 45 que un anticuerpo anti-HER4 que reconoce la isoforma JM-b de HER4.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer de mama en un paciente cuyo cáncer expresa la isoforma JM-a de HER-4, comprendiendo el procedimiento administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo.

12. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 11, en el que el procedimiento para tratar cáncer en un paciente comprende las etapas de:

a) seleccionar un paciente cuyas células cancerosas expresan o expresan en exceso la isoforma JM-a de HER55 4;y b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo.

13. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 12, en donde en el procedimiento la expresión de la isoforma JM-a de HER-4 se detecta detectando la presencia del polipéptido de isoforma JM-a, la presencia del polinucleótido 60 de isoforma JM-a, o la presencia de ectodominio de HER4 diseminado.

14. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 13, en donde en el procedimiento se detecta la presencia de ectodominio de HER4 diseminado, que comprende poner en contacto un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 con una muestra de un tumor en el paciente y detectar la unión del anticuerpo al ectodominio 65 de HER4 diseminado.

15. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 14, en el que las células cancerosas del paciente expresan la isoforma JM-a de HER-4 a niveles que son al menos:

a) 10%;

b) 20%;o c) 30% superiores a los niveles de expresión en células no cancerosas del mismo tipo de célula o en células no cancerosas adyacentes a las células cancerosas.

16. Un procedimiento de detección de la presencia del ectodominio de HER4 diseminado en una muestra de células, que comprende poner en contacto las células con un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y detectar la unión del anticuerpo al ectodominio de HER4 diseminado.