Anticuerpos anti-CXCR4 nuevos y su utilización para el tratamiento del cáncer.

Procedimiento para la selección de un anticuerpo anti-CXCR4, o uno de sus fragmentos funcionales,

siendo dicho fragmento funcional seleccionado de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc y diacuerpos, que puede inhibir la activación de CXCR4, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

i) cribar los anticuerpos generados y seleccionar los anticuerpos que pueden unirse específicamente a CXCR4 y modular asimismo la activación de CXCR4;

ii) someter a prueba los anticuerpos seleccionados de la etapa i) y seleccionar los anticuerpos que puedeninducir un cambio conformacional de los homodímeros de CXCR4, y a continuación

iii) someter a prueba los anticuerpos seleccionados de la etapa ii) y seleccionar los anticuerpos que pueden inducir un cambio conformacional de los heterodímeros de CXCR4/CXCR2.

Anticuerpos anti-CXCR4 nuevos y su utilización para el tratamiento del cáncer

La presente invención se refiere a anticuerpos nuevos, en particular a anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados, capaces de unirse específicamente a receptores de quimiocina (CXCR) así como a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican para dichos anticuerpos. Desde un aspecto, la invención se refiere a anticuerpos nuevos, compuestos derivados o fragmentos funcionales, que pueden unirse específicamente al CXCR4 y que presentan fuertes actividades antitumorales. La invención comprende además la utilización de dichos anticuerpos como un fármaco para el tratamiento preventivo y/o terapéutico del cáncer, así como en los procedimientos o kits relacionados con el diagnóstico del cáncer. Finalmente, la Invención comprende composiciones que comprenden dichos anticuerpos en combinación o conjugación con otros compuestos anticancerígenos, dichos como anticuerpos, toxinas, agentes citotóxicos/citostáticos, y la utilización de los mismos para la prevención y/o el tratamiento de determinados cánceres.

Las quimiocinas son pequeños péptidos secretados que controlan la migración de leucocitos a lo largo de un gradiente químico de ligando, conocido como gradiente de quimiocina, especialmente durante las reacciones ¡nmunitarias (Zlotnick A. et al., 2). Se dividen en dos subfamilias principales, CC y CXC, basándose en la posición de sus residuos de cisteína del extremo NH2-terminal, y se unen a receptores acoplados a proteínas G, cuyas dos subfamilias principales se denominan CCR y CXCR. Se han descubierto hasta la fecha más de 5 quimiocinas humanas y 18 receptores de quimiocina.

Muchos cánceres presentan una compleja red de quimiocinas que influye en la Infiltración de células ¡nmunitarias del tumor, así como en el crecimiento, la supervivencia, la migración y la anglogénesls de las células tumorales. Las células ¡nmunitarias, las células endoteliales y las propias células tumorales expresan receptores de quimiocina y pueden responder a gradientes de quimiocina. Estudios de muestras de biopsia de cáncer humano y modelos de cáncer de ratón muestran que la expresión de receptores de quimiocina en células cancerosas está asociada con el aumento de la capacidad metastásica. Las células malignas de diferentes tipos de cáncer presentan diferentes perfiles de expresión de receptores de quimiocina, pero el receptor 4 de quimiocina (CXCR4) es el que se encuentra más comúnmente. Las células de por lo menos 23 tipos diferentes de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimatoso y hematopoyético expresan el receptor CXCR4 (Balkwill F. etal., 24).

El receptor 4 de quimiocina (también conocido como fusina, CD184, LESTR o HUMSTR) existe como dos isoformas que comprenden 352 ó 36 aminoácidos. El residuo Asn11 está glicosilado, el residuo Tyr21 está modificado mediante la adición de un grupo sulfato y las Cys 19 y 186 están unidas con un puente disulfuro sobre la parte extracelular del receptor (Juárez J. et al., 24).

Este receptor se expresa por diferentes tipos de tejidos normales, sin tratar, células T que no son de memoria, células T reguladoras, células B, neutrófilos, células endoteliales, monocitos primarios, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales, células madre hematopoyéticas CD34+ y a un bajo nivel en corazón, colon, hígado, riñones y cerebro. CXCR4 desempeña un papel clave en el tráfico de leucocitos, la linfopoyesis de células B y la mielopoyesis.

El receptor CXCR4 se sobreexpresa en un gran número de cánceres incluyendo pero sin limitarse al cáncer de colon (Ottaiano A. et al., 24), mama (Kato M. et al., 23), próstata (Sun Y. X. et al., 23), pulmón [carcinoma de células pequeñas y de células no pequeñas (Phillips R. J. et al., 23)], ovario (Scotton C. J. et al., 22), páncreas (Koshiba T. et al., 2), riñones, cerebro (Barbero S et al., 22), glioblastoma y linfomas.

El único ligando del receptor CXCR4 descrito hasta la fecha es el factor 1 derivado de células del estroma (SDF-1) o CXCL12. SDF-1 se secreta en gran cantidad en los ganglios linfáticos, la médula ósea, el hígado, el pulmón y en un menor gado por los riñones, el cerebro y la piel. CXCR4 también se reconoce por una quimiocina antagonista, la proteína II inflamatoria de macrófagos viral (vMIP-ll) codificada por el virus herpes humano de tipo III.

El eje CXCR4/SDF-1 desempeña un papel en el cáncer y está implicado directamente en la migración, la invasión que conduce a la metástasis. De hecho, las células cancerosas expresan el receptor CXCR4, migran y entran en la circulación sistémica. A continuación, las células cancerosas se detienen en lechos vasculares en órganos que producen altos niveles de SDF-1 donde proliferan, inducen angiogénesis y forman tumores metastásicos (Murphy P. M., 21). Este eje también está implicado en la proliferación celular mediante la activación de la ruta de la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK) (Barbero S. et al., 23) y la angiogénesis (Romagnani P., 24). De hecho, el receptor CXCR4 y su ligando SDF-1 promueven claramente la angiogénesis estimulando la expresión de VEGF-A que, a su vez, aumenta la expresión de CXCR4/SDF-1 (Bachelder R. E. etal., 22). También es conocido que los macrófagos asociados a tumores (TAM) se acumulan en zonas hlpóxicas de los tumores y se estimulan para cooperar con células tumorales y promover la angiogénesis. Se observó que la hipoxia regulaba por incremento selectivamente la expresión de CXCR4 en diversos tipos celulares Incluyendo TAM (Mantovani A. et al., 24). Recientemente, se ha demostrado que el eje CXCR4/SDF-1 regula el tráflco/retorno de células progenitoras/madre hematopoyéticas CXCR4+ (HSC) y podría desempeñar un papel en la neovascularización. Las pruebas indican que

además de HSC, también se expresa CXCR4 funcional en las células madre de otros tejidos (células madre comprometidas por tejido = TCSC) por lo que SDF-1 puede desempeñar un papel fundamental en la quimioatracclón de TCSC CXCR4+ necesaria para la regeneración de órganos/tejidos, pero estas TCSC también pueden ser un origen celular del desarrollo del cáncer (teoría de las células madre cancerosas). Se demostró un origen mediante células madres del cáncer para la leucemia humana y recientemente para varios tumores sólidos tales como de cerebro y de mama. Existen varios ejemplos de tumores de CXCR4+ que pueden derivarse de células madre específicas de tejido/órgano CXCR4+ normales tales como leucemias, tumores cerebrales, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, hepatoblastoma, cánceres de ovario y de cuello uterino (Kucia M. et al., 25).

Se demostró in vivo la selección como diana de metástasis cancerosas mediante interferencia con el receptor CXCR4 utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 (Muller A. et al., 21). En resumen, se demostró que un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 (AcM 173 R&D Systems) disminuía significativamente el número de metástasis de los ganglios linfáticos en un modelo ortotóplco de cáncer de mama (MDA-MB231) en ratones SCID. Otro estudio (Phillips R. J et al., 23) también demostró el papel crítico del eje SDF-1/CXCR4 en metástasis en un modelo ortotóplco de carcinoma de pulmón (A549) utilizando anticuerpos policlonales contra SDF-1, pero en este estudio no hubo efecto ni sobre el crecimiento tumoral ni sobre la angiogénesis. Otros diversos estudios también describieron la inhibición de la metástasis in vivo utilizando siARN dúplex de CXCR4 (Liang Z. et al., 25) o antagonistas peptídicos de CXCR4 bioestables (Tamamura H. et al., 23) o bien del crecimiento tumoral in vivo utilizando antagonistas de molécula pequeña de CXCR4 como AMD 31 (Rubín J. B. et al., 23; De Falco V. et al., 27) o AcM (patente W24/59285 A2). Por tanto, CXCR4 es una diana terapéutica validada para cánceres.

El receptor 2 de quimiocina (CXCR2), otro receptor de quimiocina, también se describe como una diana interesante en oncología. De hecho, CXCR2 transmite una señal de crecimiento celular autocrlna en varios tipos de células tumorales y también puede afectar al crecimiento tumoral Indirectamente promoviendo la angiogénesis (Tanaka T. et

al. 25).

El receptor de quimiocina CXCR2 engloba 36 aminoácidos. Se expresa principalmente en células endotellales y especialmente durante la neovascularización. Varias quimiocinas se unen al receptor CXCR2: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-a, -(3 y y que pertenecen a las quimiocinas pro-angiogénicas ERL+. El receptor CXCR2 comparte homologías de secuencia con el receptor CXCR4: identidad de secuencia del 37% y homología de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la selección de un anticuerpo anti-CXCR4, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho fragmento funcional seleccionado de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab)2, Fab, scFv, scFv-Fc y dlacuerpos, que puede inhibir la activación de CXCR4, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

i) cribar los anticuerpos generados y seleccionar los anticuerpos que pueden unirse específicamente a CXCR4 y modular asimismo la activación de CXCR4;

ii) someter a prueba los anticuerpos seleccionados de la etapa i) y seleccionar los anticuerpos que pueden inducir un cambio conformacional de los homodímeros de CXCR4, y a continuación

iii) someter a prueba los anticuerpos seleccionados de la etapa ii) y seleccionar los anticuerpos que pueden inducir un cambio conformacional de los heterodímeros de CXCR4/CXCR2.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa ii) consiste en evaluar los anticuerpos mediante un análisis de BRET en células que expresan ambos CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP y seleccionar anticuerpos que pueden inhibir por lo menos 4% de la señal de BRET.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa iii) consiste en evaluar los anticuerpos mediante un análisis de BRET en células que expresan ambos CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP y seleccionar anticuerpos que pueden inhibir por lo menos 4% de la señal de BRET.

4. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, siendo dicho fragmento funcional seleccionado de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab)2, Fab, scFv, scFv-Fc y diacuerpos, que puede inhibir la activación de CXCR4, caracterizado por que dicho anticuerpo es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo que comprende:

- una cadena ligera que comprende, según el IMGT, la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 1, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 2 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 3; y

- una cadena pesada que comprende, según el IMGT, la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 7, la CDR-FI2 de la secuencia SEC ID n° 5 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 8;

b) un anticuerpo que comprende:

- una cadena ligera que comprende, según Kabat, la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 9, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 1 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 3; y

- una cadena pesada que comprende, según Kabat, la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 11, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 12 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 6;

c) un anticuerpo que comprende:

- una cadena ligera que comprende, según el IMGT, la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 4, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 2 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 41; y

- una cadena pesada que comprende, según el IMGT, la CDR-FI1 de la secuencia SEC ID n° 44, la CDR- H2 de la secuencia SEC ID n° 5 y la CDR-FI3 de la secuencia SEC ID n° 45; y

d) un anticuerpo que comprende:

- una cadena ligera que comprende, según Kabat, la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 46, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 47 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n°41; y

- una cadena pesada que comprende, según Kabat, la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 48, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 49 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 43.

5. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según la reivindicación 4, caracterizado por que dicho anticuerpo es seleccionado de entre el grupo constituido por:

a) anticuerpo que comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 13, y que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 14; y

b) un anticuerpo que comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5 y que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 51.

6. Anticuerpo secretado por un hibridoma murino seleccionado de entre el hlbridoma presentado en el CNCM, Instituto Pasteur, París, el 22 de octubre de 27, con el número I-386 o presentado en el CNCM, Instituto Pasteur, París, el 25 de junio de 28, con el número 1-419.

7. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según la reivindicación 4, caracterizado por que dicho anticuerpo consiste en un anticuerpo quimérico.

8. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según la reivindicación 7, caracterizado por que dicho anticuerpo es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo quimérico que comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 64, y por que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 65; y

b) un anticuerpo quimérico que comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 66, y por que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 67.

9. Ácido nucleico aislado caracterizado por que dicho ácido nucleico aislado es un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo según una de las reivindicaciones 5 u 8.

1. Vector compuesto por un ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 1.

12. Animal transgénico, excepto el hombre, que comprende una célula transformada mediante un vector según la reivindicación 1.

13. Procedimiento para producir un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, siendo dicho fragmento funcional seleccionado de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab)2, Fab, scFv, scFv-Fc y diacuerpos, según una de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado por que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

- cultivar en un medio de las condiciones de cultivo adecuadas para una célula huésped según la reivindicación 11; y

- recuperar dicho anticuerpo, así producido a partir del medio de cultivo o a partir de dichas células cultivadas.

14. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según una de las reivindicaciones 4 a 8, para su utilización como un fármaco.

15. Composición farmacéutica que comprende como principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, según una de las reivindicaciones 4 a 8 y 14.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, caracterizada por que comprende, además, como producto de combinación para su utilización de una manera simultánea, separada o prolongada, un anticuerpo antitumoral distinto de un anticuerpo dirigido contra CXCR4.

17. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 15 o 16, caracterizada por que comprende, además, como producto de conjugación o combinación para su utilización de una manera simultánea, separada o prolongada, un agente citotóxico/citostático, una toxina celular y/o un radioisótopo.

18. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 15 a 17, para su utilización como un fármaco.

19. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según una de las reivindicaciones 4 a 8 y 16, y/o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, como fármaco para modular la actividad de CXCR4 en una célula.

2. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, según una de las reivindicaciones 4 a 8 y 16, y/o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, para el uso en la prevención o el tratamiento del cáncer.

21. Anticuerpo o fragmento funcional del mismo, y/o composición de acuerdo con el uso según la reivindicación 2, caracterizado por que dicho cáncer es un cáncer seleccionado de entre cáncer de próstata, osteosarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer endometrial, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático y cáncer

de colon.

22. Hibridoma murino seleccionado de entre el hibridoma presentado en el CNCM, Instituto Pasteur, París, el 22 de octubre de 27, con el número I-386 o presentado en el CNCM, Instituto Pasteur, París, el 25 de junio de 28, con el número 1-419.