Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividad antitumoral in vivo.

Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo,

en donde:

- las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32, respectivamente; y

- las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35, respectivamente.

Anticuerpo anti-DLK-1 humana que muestra la actividadantitumoral in vivo Campo técnico La presente invención se refiere a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral y en particular a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención también se refiere a hibridomas que producen los anticuerpos antes mencionados y al uso de los anticuerpos antes mencionados.

Técnica anterior

La Dlk-1 humana (homólogo de tipo delta 1 (Drosophila) ; que se puede denominar en lo sucesivo "hDlk-1") es una proteína transmembrana de tipo I (de tipo transmembrana uno) con una longitud total de 383 residuos de aminoácidos que tiene con 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. La región extracelular presenta homología con una familia Notch/Delta/Serrate. Un gen hDlk-1 ha sido clonado como una molécula expresada en una línea celular derivada de carcinoma de pulmón de células pequeñas sensible a GRP (péptido liberador de gastrina) (Documento No de Patente 1) , o como un factor para la supresión de la diferenciación de preadipocitos (Documento No de Patente 2) . Desde el punto de vista de la homología de la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 con la de Delta que es un ligando de un receptor Notch como regulador de la diferenciación celular, tal Dlk-1 es referida generalmente como un símbolo génico, DLK1. También tiene algunos otros símbolos génicos tales como Pref-1 (Documento No de Patente 2) , PG2 (Documento No de Patente 3) , SCP-1 (Documento No de Patente 4) y ZOG (Documento No de Patente 5) . Sin embargo, estos símbolos génicos indican básicamentela mismamolécula.

Por otra parte, hDlk-1 se escinde con una proteasa no identificada que corta en las proximidades de la membrana celular en la región extracelular de hDlk-1, y se secreta a continuación a la sangre. La hDlk-1 libre (región extracelular de hDlk-1) es una molécula idéntica a una glicoproteína llamada FA-1 (Antígeno fetal 1) (Documento No de Patente 6) que consiste en 225 a 262 residuos de aminoácidos.

El gen hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan a un alto nivel en las células no diferenciadas, altamente proliferativas, fetales. En particular, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo son altamente expresados en hígado fetal, riñón fetal, músculo esquelético fetal, cerebro fetal y similares. Después del nacimiento, sin embargo, la expresión de tal gen hDlk-1 y del producto génico del mismo puede no ser observado en la mayoría de los tejidos. En tejidos adultos normales, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se localizan en la glándula suprarrenal, la placenta y la hipófisis (Documento de Patente 1, DocumentoNo de Patente 2) .

Además, incluso en tejidos maduros, la expresión de hDlk-1 se observó en células que se considera que son células madre no diferenciadas o células precursoras. Por ejemplo, se ha informado de que la expresión de hDlk-1 se ha observado en células ovales hepáticas que son indiferenciadas y tienen pluripotencia en hígado adulto (Documentos No de Patente 7 y 8) o en células madre mesenquimales que son las células madre de las células óseas/de cartílago/adiposas (Documento No de Patente 9) . Se ha sugerido que hDlk-1 está asociado con las propiedades de tales células madre de tejidos, tales como el mantenimiento de la capacidad de indiferenciación.

Tal patrón de expresión de hDlk-1 localizado en las células fetales o células y una familia de genes/productos génicos que tienen motivos de tipo EGF (receptor Notch, ligando de Notch (Delta, Jagged, Serrate) , etc.) generalmente controla el crecimiento o la diferenciación de células por la interacción intercelular a través de motivos de tipo EGF. Por lo tanto, se ha sugerido que hDlk-1 también tiene tales funciones. De hecho, se ha conocido que la expresión de hDlk-1 disminuye simultáneamente a la diferenciación de las células precursoras adiposas y que la diferenciación adiposa se suprime, si el gen hDlk-1 se ve obligado a expresarse en las células precursoras adiposas (Documento no de Patente 2) . Sin embargo, en la actualidad, los detalles con respecto a una molécula (un ligando) que interactúe con hDlk-1 son desconocidos.

Por otra parte, se ha informado de que el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se expresan con una alta frecuencia en diversos tipos de cánceres o tumores. Los tipos de cáncer, en los que la expresión de hDlk-1 se ha confirmado hasta el momento, son: cánceres sólidos tales como un tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis de tipo 1, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de riñón y cáncer de ovario (Documentos de Patente 1 y 2 y Documentos No de Patente 1, 3, 10, 11, 12, 13 y 14) ; y cánceres de la sangre tales como el síndrome mielodisplásico (Documento de Patente 3 y Documentos No de Patente 15 y 16) y leucemia mielocítica aguda (Documento No de Patente 16) . Se ha informado de que el crecimiento celular se acelera si se introduce un gen hDlk-1 en una célula K562 que es una línea celular de eritroleucemia (Documento No de Patente 16) y también que, si tal gen hDlk-1 se introduce en glioblastomas, causa la desaparición de la inhibición por contacto de las células, así como la aceleración del crecimiento celular, de manera que se puede lograr la capacidad de crecimiento celular independiente de anclaje. Se ha sugerido la relación entre hDlk-1 y la

carcinogénesis (Documento No de Patente 17) .

<Documentos de Patente>

Documento de Patente 1: Documento WO 2005/052156 (EP1702982 A1) Documento de Patente 2: Documento WO 02/081625 Documento de Patente 3: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm. 2001-269174

<Documentos No de Patente>

Documento No de Patente 1: Laborda, J. et al., J. Biol. Chem., Vol. 268 (6) , págs. 3817-3820 (1993) Documento No de Patente 2: Smas, C. M. et al., Cell, vol. 73 (4) , págs. 725-734 (1993) Documento No de Patente 3: Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, págs. 2336-2339 (1987) Documento No de Patente 4:. Maruyama, K. et al, No publicado, número de acceso Genebank D16847 (1993) Documento No de Patente 5: Halder, S. K. et al., Endocrinology, vol. 139, págs. 3316-3328 (1998) Documento No de Patente 6: Fay, T. N. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., Vol. 29, págs. 73-85 (1988) Documento No de Patente 7: Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol. 5, págs. 209-218 (2004) Documento No de Patente 8: Jensen, CH. et al., Am. J. Pathol., Vol. 164 (4) , págs. 1347-1359 (2004) Documento No de Patente 9: Abdallah, B. M. et al., J. BoneMiner. Res., Vol. 19 (5) , págs. 841-852 (2004) Documento No de patente 10: Jensen, C. H. et al., Fr. J. Dermatol., Vol. 140 (6) , págs. 1054-1059 (1999) Documento No de patente 11: Jensen, C. H. et al., Tumor Biol., Vol. 20 (5) , págs. 256-262 (1999) Documento No de patente 12: Yin, D. et al., Int. J. Oncol., Vol. 24 (4) , págs. 1011-1015 (2004) Documento No de patente 13: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13) , págs. 1852-1861 (2006) Documento No de patente 14: Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., Vol. 58, págs. 145-150 (2006) Documento No de patente 15: Miyazato, A. et al., Blood, vol. 98, págs. 422-427 (2001) Documento No de patente 16: Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol. 19 (8) , págs. 1404-1410 (2005) Documento No de patente 17: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13) , págs. 1852-1861 (2006)

Descripción de la invención Como se describió anteriormente, en el caso de los tejidos normales, la expresión de hDlk-1 se localiza en las células embrionarias o las células madre. Sin embargo, en el caso de tejidos cancerosos, hDlk-1 se expresa con una alta frecuencia en diversos tipos de células. Tal hDlk-1 es una proteína de la membrana celular/proteína secretora. Basándose en estos hechos, se considera que hDlk-1 es una buena diana en el tratamiento de diversos tipos de tumores, etc. Cuando se elige como diana tal hDlk-1, se considera que es útil un anticuerpo anti-hDlk-1.

Por lo tanto, un objeto de la presente invenición es proporcionar un anticuerpo anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral y, en particular, un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral in vivo. Por otra parte, otro objeto de la presente invención es proporcionar un hibridoma que produzca el anticuerpo anteriormente mencionado, un complejo del anticuerpo anteriormente mencionado y un agente, una composición farmacéutica para el diagnóstico o tratamiento de un tumor, un método para detectar un tumor y un kit para la detección o el diagnóstico de un tumor.

Los autores de la presente invención han realizado estudios exhaustivos dirigidos a la consecución... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo, en donde: -las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32, respectivamente; y -las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo son las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35, respectivamente.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde 10 (a) laactividadantitumoraleslaactividadinhibidoradelaangiogénesisantitumoral;

(b) dicho anticuerpo es un anticuerpomonoclonal; y/o

(c) el tumor es al menos un tipo seleccionado entre cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano; y/o

(d) dicho anticuerpo es un anticuerpo genéticamenterecombinante. 15

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que un anticuerpo genéticamente recombinante y es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, que es un anticuerpo quimérico y la secuencia de aminoácidos

de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 25.

5. Un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, que es producida por un hibridoma que tiene el Núm. de acceso FERM BP-10707, FERM BP-10899, o FERM BP-10900.

6. Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral in vivo y que se une a:

(a) un epítopo de Dlk-1 humana al que se une un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el 30 Núm. de acceso FERM BP-10707 o FERM BP-10900; y/o

(b) al menos una porción de una región que comprende los aminoácidos de las posiciones 26 a 85 o una región que comprende los aminoácidos de las posiciones 131 a 244, en la secuencia de aminoácidos de Dlk-1 humana como semuestra en el SEQ ID NO: 2.

7. Un fragmento de anticuerpo que se une a Dlk-1 humana, que tiene actividad antitumoral en vivo, que deriva delos anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y que comprende:

(a) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 30 a 32; y/o

(b) las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L del anticuerpo que tiene las 40 secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NO: 33 a 35.

8. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, que es un Fab, Fab', F (ab') 2, Fv, un anticuerpo monocatenario, scFv, diacuerpo o dsFv.

9. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones 20 a 137 en la secuencia de aminoácidosmostrada en el SEQ ID NO: 23; y/o

(b) la secuencia de ácidos que consiste en los aminoácidos 21 a 132 en la secuencia de aminoácidos mostrada

en el SEQ ID NO: 25. 50

10. Un hibridoma, que produce:

(a) el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 6; o

(b) un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene el Núm. de acceso FERM BP-10707; o

(c) un anticuerpo monoclonal contra Dlk-1 humana, quetiene el Núm. de acceso FERM BP-10899, o 55 (d) unanticuerpomonoclonalcontraDlk-1humana, quetieneelNúm.deaccesoFERMBP-10900.

11. Un complejo, que comprende un compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células,

y:

(a) el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera delas reivindicaciones 1 a 6; o 60 (b) el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

12. El complejo de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:

(i) la actividad antitumoral es la actividad inhibidora de la angiogénesis antitumoral; y/o

(ii) el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.

13. Una composición farmacéutica, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.

14. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el complejo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 o la composición de acuerdo con la reivindicación 13 para su usoen un método para el tratamiento de untumor.

15. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición para su uso en un método para el tratamiento de un tumor de acuerdo con lareivindicación 14, en donde:

(i) el tratamiento del tumor indica inhibición de la angiogénesis tumoral;

(ii) dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo, complejo o composición no causa reducción de peso como efecto secundario; y/o

(iii) el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.

16. Un agente de diagnóstico de tumores, que comprende al menos un del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.

17. El agente de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.

18. Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir que al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, reaccione con una muestra recogida del un organismo vivo; y detectar una o varias señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que han reaccionado.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.

20. A kit para tratar, diagnosticar, o detectar un tumor, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y el complejo de acuerdo conla reivindicación 11 o 12.

21. El kit de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer demama humano, cáncer de hígado humano y neuroblastoma humano.