Análisis de copolímeros.

Un método para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer,

comprendiendo el método:

(a) proporcionar al menos una célula mieloide;

(b) poner en contacto al menos una célula mieloide con una cantidad de acetato de glatiramer e IFN-γ a una concentración y un periodo de tiempo suficiente para inducir que la célula exprese una o más proteínas inducidas por IFN-γ seleccionadas del grupo que consiste en: proteína 10 inducible por interferón- &gamma: (IP-10), quimioatrayente-α de células T inducible con interferón (I-TAC) y monocina inducida por interferón-γ (MIG) y

(c) detectar la proteína inducida seleccionada del grupo que consiste en: proteína 10 inducible por interferón- γ (IP- 10), quimioatrayente-α de células T inducible con interferón (I-TAC) y monocina inducida por interferón-γ (MIG) para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer.

Anïlisis de copolïmeros.

Campo El contenido descrito en el momento presente se refiere en general a mïtodos para caracterizar mezclas complejas de pïptidos o polipïptidos. Mïs en particular, el contenido descrito en el momento presente se refiere a mïtodos basados en cïlulas para evaluar una o mïs propiedades de un copolïmero de aminoïcidos.

Antecedentes El copolïmero-1 es una mezcla compleja de polipïptidos preparados a partir de la polimerizaciïn de los aminoïcidos: ïcido glutïmico, lisina, alanina y tirosina. El copolïmero-1 tambiïn es conocido como acetato de glatiramer y presenta la siguiente fïrmula estructural:

(Glu, Ala, Lys, Tyr) x XCH3COOH

(C5H9NO4 •C3H7NO2 •C9H14N2O2 •C9H11NO3) x •XC2H4O2

El acetato de glatiramer (GA, por sus siglas en inglïs) es el ingrediente activo de COPAXONEï (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel) , que comprende las sales de acetato de polipïptidos sintïticos que contienen cuatro aminoïcidos que se encuentran en la naturaleza: ïcido L-glutïmico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina, con una fracciïn molar promedio reseïada de 0, 141; 0, 427; 0, 095 y 0, 338, respectivamente.

El acetato de glatiramer se usa en el tratamiento de la forma con recaïdas y remisiones de la esclerosis mïltiple (RRMS, por sus siglas en inglïs) .

El artïculo por Li et al., European Journal of Pharmacology, 342, 1.998, 303-310, describe que el acetato de glatiramer bloquea la activaciïn de THP-1 por IFN-!.

La patente internacional WO 03/048735 A2 describe un procedimiento para medir la potencia relativa de un lote de ensayo de acetato de glatiramer.

El artïculo por Li et al., Journal of Neurochemistr y , 2.001, 77, 1.208-1.217, se refiere a la inhibiciïn del acetato de glatiramer de la expresiïn de RANTES inducida por TNF-∀ y la liberaciïn de cïlulas astrocïticas humanas U-251 MG.

El artïculo por Milo et al., Journal of Neuroimmunology, 61, 1.995, 185-193, se refiere a efectos aditivos de acetato de glatiramer e interferïn β-1b sobre la respuesta inmunitaria a la proteïna bïsica de mielina.

El artïculo por Farina et al., Brain, 2.001, 124, 705-719, describe el tratamiento de esclerosis mïltiple con Copaxone.

El artïculo por Abdelaziz et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2.004, 288, se refiere a la inhibiciïn de la producciïn de TNF-∀ en macrïfagos de THP-1 por acetato de glatiramer.

Sumario La presente invenciïn proporciona mïtodos y composiciones para evaluar una o mïs propiedades de un agente candidato, es decir el copolïmero de aminoïcidos acetato de glatiramer, como se definiï en las reivindicaciones 1, 2, 9, 10 y 12. En un aspecto, la invenciïn proporciona una variedad de realizaciones para evaluar una preparaciïn de copolïmero de aminoïcidos para propiedades fisiolïgicas, farmacodinïmicas, farmacocinïticas o farmacïuticas incluyendo, pero no limitado a, potencia, especificidad, estabilidad, actividad biolïgica, por ej., para conveniencia como una preparaciïn farmacïutica, por ej., para el tratamiento de enfermedad, trastornos o disfunciones autoinmunitarias y/o inflamatorias.

Una o mïs propiedades de la preparaciïn de copolïmero de aminoïcidos (por ej., de una preparaciïn de copolïmero de aminoïcidos de ensayo) , tal como potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biolïgica, se pueden evaluar comparando los resultados del anïlisis (por ej., un valor de ensayo cualitativo o cuantitativo que corresponde a la inducciïn, producciïn, secreciïn, presencia o nivel de una proteïna regulada) con un valor de referencia, por ej., un valor predeterminado para correlacionarse con un nivel particular de potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biolïgica de copolïmero, por ej., un valor predeterminado para correlacionarse con un nivel de potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biolïgica del copolïmero adecuado para una preparaciïn farmacïutica ïtil para tratar una enfermedad, trastorno o disfunciïn descrita en la presente memoria. En una realizaciïn, el valor de referencia es un perfil de inducciïn de citocinas, rango de equivalencia o especificaciïn farmacïutica para potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biolïgica para una preparaciïn farmacïutica comercializada de acetato de glatiramer. En otras realizaciones, el valor de referencia es un valor determinado por mediciïn directa de una propiedad de un compuesto de referencia, por ej., una preparaciïn de acetato de glatiramer de referencia. En una realizaciïn, el valor de ensayo se considera comparable al valor de referencia si estï dentro de 25%, 20%, 15%,

10%, 5%, 2%, 1% o menos del valor de referencia.

En una realizaciïn, la cïlula usada en el ensayo es un leucocito, es decir una cïlula mieloide, por ej., una estirpe celular mieloide o cïlula primaria, por ej., cïlula mononuclear de la sangre (por ej., cïlulas T, cïlulas destructoras naturales, monocitos, macrïfagos, etc.) , cïlula polimorfonuclear de la sangre (por ej., eosinïfilos, basïfilos, neutrïfilos, megacariocitos, etc.) , cïlula dendrïtica y cïlula tïmicas. La cïlula puede ser una estirpe celular mieloide tumorigïnica tal como THP-1, U937, SiHa o HL-60. Adicionalmente, se pueden usar cïlulas mononucleares de sangre perifïrica de mamïferos asï como monocitos procedentes de mïdula ïsea y monocitos.

En una realizaciïn, la proteïna regulada por la molïcula proinflamatoria IFN-! (cuya inducciïn, producciïn, secreciïn, presencia o nivel se detecta en el ensayo) es una quimiocina, por ej., una quimiocina regulada por IFN-!. En una realizaciïn, la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) , monocina inducida por interferïn-! (MIG) . Otras proteïnas o citocinas solubles inducidas por IFN-! incluyen las mostradas en la Tabla 1. La inducciïn, producciïn, secreciïn, presencia o nivel de una proteïna regulada se puede detectar directamente, por ej., por un mïtodo basado en anticuerpo, tal como un ELISA o indirectamente, por ej., por tïcnicas conocidas en la tïcnica para detectar transcripciones para la proteïna o por uso de un anïlisis de gen informador.

En algunas realizaciones, la exposiciïn de la cïlula o las cïlulas al copolïmero de aminoïcidos e IFN-! da como resultado una inducciïn sinïrgica de una o mïs de las proteïnas reguladas por citocina. En un ejemplo, la exposiciïn de cïlulas mieloides al copolïmero de aminoïcidos acetato de glatiramer e IFN! da como resultado una inducciïn sinïrgica de una o mïs quimiocinas o citocinas reguladas por IFN! (por ej., de IP-10, I-TAC, MIG y/u otros ligandos de CXCR3) . En una realizaciïn, la inducciïn de una citocina regulada puede ser al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 300 veces o mïs por encima de los valores de control (por ej., por encima de controles negativos sin molïcula proinflamatoria y/o sin copolïmero) .

La invenciïn proporciona ademïs un mïtodo para preparar una composiciïn farmacïutica de acetato de glatiramer que comprende preparar un lote de acetato de glatiramer, evaluar la potencia, especificidad, actividad biolïgica y/o estabilidad de la composiciïn por un mïtodo descrito en la presente memoria y determinar que el acetato de glatiramer es aceptable para uso farmacïutico si se detecta al menos un nivel predeterminado de una o mïs proteïnas reguladas por la citocina y/o si la proteïna regulada se induce a un nivel dentro del 80%-125% (por ej., al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%, 110%, 115%, 120%, 125%) de un valor de referencia.

Tambiïn se describe un mïtodo para preparar una composiciïn farmacïutica que comprende acetato de glatiramer, que comprende: polimerizar N-carboxianhïdridos de L-alanina, ïcido L-glutïmico bencil-protegido, L-lisina y Ltirosina protegidas con ïcido trifluoroacïtico (TFA) para generar un copolïmero protegido; tratar el copolïmero protegido para despolimerizar parcialmente el copolïmero protegido y desproteger grupos bencil-protegidos y desproteger lisinas protegidas con TFA para generar acetato de glatiramer y aislar el acetato de glatiramer, en el que la mejora comprende: medir la expresiïn de una proteïna inducida por IFN-! en una cïlula mieloide o una estirpe celular mieloide primaria en presencia de IFN-! y una muestra del acetato de glatiramar aislado y comparar la expresiïn con el valor de referencia. En diversas realizaciones de este mïtodo de preparaciïn: la mejora comprende ademïs seleccionar el acetato de glatiramer purificado para uso en la preparaciïn de una composiciïn... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer, comprendiendo el mïtodo:

(a) proporcionar al menos una cïlula mieloide;

(b) poner en contacto al menos una cïlula mieloide con una cantidad de acetato de glatiramer e IFN-! a una concentraciïn y un periodo de tiempo suficiente para inducir que la cïlula exprese una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! seleccionadas del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) y

(c) detectar la proteïna inducida seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer.

2. Un mïtodo para evaluar acetato de glatiramer, comprendiendo el mïtodo:

(a) proporcionar al menos una cïlula mieloide que es capaz de expresiïn de una proteïna que es inducida por IFN-! seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) ;

(b) poner en contacto al menos una cïlula mieloide con una cantidad de acetato de glatiramer e IFN-! a una concentraciïn y durante un periodo de tiempo suficiente para inducir que la cïlula exprese la proteïna inducida;

(c) medir la expresiïn, secreciïn, inducciïn, presencia o nivel de la proteïna inducida seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) y

(d) comparar la expresiïn, secreciïn, inducciïn, presencia o nivel, medido, de la proteïna inducida con un valor de referencia, un perfil de inducciïn de citocinas o una especificaciïn farmacïutica para una preparaciïn farmacïutica del mercado de acetato de glatiramer para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer.

3. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 1, que comprende ademïs una etapa (d) de comparar un valor para la producciïn, secreciïn, inducciïn, presencia o nivel de una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! con un valor de referencia, un perfil de inducciïn de citocinas o una especificaciïn farmacïutica para una preparaciïn farmacïutica comercializada de acetato de glatiramer.

4. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 3, en el que el valor de referencia, el perfil de inducciïn de citocinas o la propiedad de especificaciïn farmacïutica para la preparaciïn farmacïutica comercializada de acetato de glatiramer es un valor que corresponde a una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: potencia, especificidad, estabilidad, actividad y combinaciones de las mismas.

5. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en el que la concentraciïn de IFN-! en la etapa (b) induce la expresiïn de una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! a un nivel mayor que la suma de: i) la expresiïn de una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! cuando la cïlula se pone en contacto con acetato de glatiramer en ausencia de IFN-! y ii) la expresiïn de una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! cuando la cïlula se pone en contacto con IFN-! en ausencia de acetato de glatiramer.

6. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 5, en el que la concentraciïn de IFN-! estï entre 0, 01 ng/ml y 100 ng/ml, entre 1 ng/ml y 50 ng/ml o 10 ng/ml.

7. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en el que el periodo de tiempo es entre 1 hora y 48 horas, entre 6 horas y 36 horas o entre 12 horas y 24 horas.

8. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en el que la concentraciïn del acetato de glatiramer estï entre 0, 5 μg/ml y 100 μg/ml, IFN-! estï presente a entre 1 ng/ml y 50 ng/ml y el periodo de tiempo es entre 12 horas y 24 horas y las cïlulas son cïlulas THP-I.

9. Un mïtodo para comparar al menos dos muestras de acetato de glatiramer, en el que al menos uno del acetato de glatiramer es un estïndar de referencia, comprendiendo el mïtodo:

(a) proporcionar al menos una cïlula mieloide;

(b) poner en contacto por separado al menos una cïlula mieloide con:

(i) una cantidad de una primera muestra de acetato de glatiramer a una concentraciïn y periodo de tiempo suficiente para inducir que la cïlula exprese una proteïna inducida por IFN-! seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina

inducida por interferïn-! (MIG) y

(ii) una cantidad de una segunda muestra de acetato de glatiramer a una concentraciïn y periodo de tiempo suficiente para inducir que la cïlula exprese la proteïna inducida por IFN-! seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) ;

(c) detectar la proteïna inducida por IFN-! expresada por al menos una cïlula mieloide en la etapa (b) (i) para valorar una propiedad de la primera muestra de acetato de glatiramer;

(d) detectar la proteïna inducida por IFN-! expresada por al menos una cïlula en la etapa (b) (ii) para valorar una propiedad de la segunda muestra de acetato de glatiramer y

(e) comparar la propiedad de la primera muestra de acetato de glatiramer a la propiedad de la segunda muestra de acetato de glatiramer para determinar una similitud entre la primera y segunda muestras.

10. Un mïtodo de preparaciïn de una composiciïn farmacïutica de acetato de glatiramer, comprendiendo el mïtodo:

(a) proporcionar un lote de acetato de glatiramer;

(b) evaluar una propiedad del lote segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y

(c) determinar que el lote es aceptable para uso farmacïutico si el nivel de una o mïs proteïnas inducidas por IFN-! iguala a un valor de referencia para acetato de glatiramer.

11. El mïtodo segïn la reivindicaciïn 10, en el que el valor de referencia es un perfil de inducciïn de citocinas, intervalo de equivalencia o especificaciïn farmacïutica para potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biolïgica para una preparaciïn farmacïutica comercializada de acetato de glatiramer.

12. Un mïtodo para evaluar la actividad, potencia, especificidad o estabilidad de una preparaciïn de acetato de glatiramer, comprendiendo el mïtodo:

(a) proporcionar una cïlula mieloide;

(b) poner en contacto la cïlula con:

(i) una cantidad de acetato de glatiramer e

(ii) IFN-!, a una concentraciïn y un periodo de tiempo suficiente para inducir que la cïlula exprese una proteïna inducida por IFN-! seleccionada del grupo que consiste en: proteïna 10 inducible por interferïn-! (IP-10) , quimioatrayente-∀ de cïlulas T inducible con interferïn (I-TAC) y monocina inducida por interferïn-! (MIG) y

(c) comparar la presencia, el nivel, la producciïn, secreciïn, inducciïn de la proteïna inducida por IFN-! con un valor de referencia para acetato de glatiramer.

13. El mïtodo segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proteïna inducida por IFN-! es IP-10.

14. El mïtodo segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proteïna inducida por IFN-! es I-TAC.

15. El mïtodo segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proteïna inducida por IFN-! es MIG.