Administración dirigida de fármacos, ácidos nucleicos terapéuticos y ácidos nucleicos funcionales a célula de mamífero por medio de células bacterianas muertas intactas.

Una composición que comprende (I) una pluralidad de células bacterianas muertas intactas,

pluralidad de la que cada célula bacteriana muerta posee una pared celular y/o membrana celular intacta, que contienen material genético que es endógeno de la especie bacteriana, y que engloba (i) un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto, tal como un péptido, un polipéptido o una proteína, cuya producción se desea en una célula objetivo, (ii) un fármaco que es una sustancia fisiológica o farmacéuticamente activa que produce un efecto local o sistémico deseado en mamíferos y seres humanos o (iii) una molécula de ácido nucleico funcional, que tras la introducción en una célula huésped, interfiere específicamente con la expresión de una proteína, (II) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas y (III) un ligando biespecífico unido a cada célula bacteriana muerta intacta.

Administración dirigida de fármacos, ácidos nucleicos terapéuticos y ácidos nucleicos funcionales a célula de mamífero por medio de células bacterianas muertas intactas Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la administración dirigida, por medio de células bacterianas muertas intactas, de moléculas bioactivas, incluidos ácidos nucleicos terapéuticos, ácidos nucleicos funcionales, fármacos, péptidos, proteínas, hidratos de carbono y lípidos, a células huésped de mamífero.

Existen una serie de obstáculos que siguen suponiendo un reto para la administración dirigida de moléculas bioactivas a célula de mamífero (p. ej., células cancerosas) , en particular in vivo. Esos obstáculos incluyen (a) la composición, las características funcionales y la estabilidad de los vehículos de administración, (b) introducir concentraciones terapéuticamente significativas de moléculas bioactivas, (c) dirigirse a células enfermas deseadas in vivo, (d) superar una serie de barreras intracelulares y administrar con éxito concentraciones terapéuticas de moléculas bioactivas a objetivos intracelulares, (e) evitar una serie de elementos inmunitarios del huésped tales como los anticuerpos, el complemento y los macrófagos que pueden destruir un vector antes de que alcance un objetivo, (f) atravesar la barrera endotelial de las paredes de los vasos sanguíneos, en particular en el emplazamiento de una masa tumoral, (g) migrar a través de varias capas de células para alcanzar un objetivo (p. ej., se sabe que un tumor sólido es una estructura organizada que contiene tanto células tumorales como células sanas; por tanto, un vector debe atravesar varias capas de células sanas para acceder a las células malignas) , (h) migrar a través de una matriz extracelular (MEC) que comprende glucoproteínas, glucosaminoglucanos sulfatados, hialuronano, proteoglucanos y colágeno que rellena el espacio entre las células y, por lo tanto, impide el transporte de un vector, y (i) abordar la hipertensión intersticial alta (presión hidrostática elevada fuera de los vasos sanguíneos) en el microentorno del tumor, lo que puede limitar el acceso de las moléculas bioactivas.

Se han propuesto una serie de vectores diferentes para la administración tanto de ácidos nucleicos como de fármacos que incluyen vectores víricos, no víricos no vivos y no víricos vivos. Los vectores no víricos no vivos se han adaptado para la administración tanto de ácidos nucleicos como de fármacos. Los otros dos tipos de vectores se han adaptado para la administración de ácidos nucleicos. Los vectores no víricos vivos se están desarrollando principalmente para aplicaciones de destrucción directa de células tumorales. Aunque tienen ventajas, estos vectores también presentan inconvenientes.

Se han desarrollado vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de la viruela, virus del herpes simple y lentivirus, para la administración de genes. Sin embargo, los vectores víricos no pueden administrar genes de forma sistemática y específica a células tumorales primarias y/o metastatizadas sin infectar tejidos sanos (Akporiaye y Hers, 1999; Biederer et al., 2002; Green y Seymour, 2002) . Adicionalmente, la extremadamente limitada capacidad de difusión de los viriones en los espacios extracelulares impide significativamente la propagación de los vectores víricos. Además, los virus son antigénicos y, por lo tanto, dan lugar a respuestas inmunitarias en el huésped. Estas respuestas inmunitarias incluyen tanto respuestas adaptativas como respuestas innatas inespecíficas (Chen et al., 2003; Ferrari et al., 2003; Wakimoto et al., 2003) . Estas últimas desempeñan un papel importante en la eliminación de vectores adenovíricos (Liu y Muruve, 2003) y de VHS (Wakimoto et al., 2003) .

Los vectores no víricos no vivos se ejemplifican con polímeros catiónicos (poliplexos) , lípidos catiónicos (liposomas, lipoplexos) y nanopartículas sintéticas (nanoplexos) . Son más versátiles que los vectores víricos y ofrecen varias ventajas distintas porque se puede controlar su composición molecular, la fabricación y el análisis de estos vectores es bastante sencilla, pueden incluir una variedad de tamaños de transgenes (Kreiss et al., 1999; de Jong et al., 2001) y son menos inmunógenos (Whitmore et al., 1999, 2001; Dow et al., 1999; Ruiz et al., 2001) . No obstante, la eficacia de la administración génica con vectores no víricos no vivos es significativamente menor que con vectores víricos. Se necesitan al menos 106 copias de plásmidos para transfectar una sola célula, de las que aproximadamente 102-104 copias llegan realmente hasta el núcleo para la expresión de los transgenes (Felgner y Ringold, 1989; James y Giorgio, 2000; Tachibana et al., 2002) . Esta ineficacia se puede atribuir a la incapacidad de los vectores no víricos no vivos para superar los numerosos desafíos que encuentran entre el sitio de administración y la localización en el núcleo de la célula objetivo, incluidos, (a) la estabilidad física y química del ADN y su vehículo de administración en el espacio extracelular, (b) la incorporación celular por endocitosis, (c) el escape de los compartimentos endosómicos antes del tránsito hacia los liposomas y el transporte citosólico y (d) la localización del plásmido en el núcleo para la transcripción. Además de estos obstáculos físicos y químicos, existen barreras biológicas, tales como respuestas inmunógenas frente al propio vector y la estimulación inmunitaria por determinadas secuencias de ADN que contienen un motivo CpG central sin metilar (Yew et al., 1999; Scheule, 2000; Ruiz et al., 2001) .

Como alternativa a los vehículos de administración de ácidos nucleicos/fármacos no vivos, también se han desarrollado vectores bacterianos vivos para el tratamiento dirigido de tumores (Pawalek et al., 2003; Soghomonyan et al., 2005) . Estos vectores no llevan una carga útil de ácidos nucleicos o fármacos, sino que, de forma preferente,

se acumulan en células tumorales, se replican intracelularmente y destruyen las células infectadas (Pawelek et al., 1997) . Se cree que este fenómeno está facilitado por un sistema bacteriano complejo para introducir proteínas bacterianas directamente en las células de mamífero, lo que puede dar lugar en la inducción de la apoptosis (Chen et al., 1996; Monack et al., 1996; Zhou et al., 2000) . Actualmente, se están investigando como vectores bacterianos vivos selectivos de tumores las bifidobacterias (Yazawa et al., 2000; 2001; Li et al., 2003) , las Clostridium (Minton et al., 1995; Fox et al., 1996; Lemmon et al., 1997; Theys et al., 2001; Dang et al., 2001; Nuyts et al., 2002a; 2002b; Liu et al., 2002) las Salmonella (Pawelek et al., 1997; Low et al., 1999; Platt et al., 2000; Luo et al., 2001; Rosenberg et al., 2002) y los vibrios (Yu et al., 2004) .

También se han explorado las bacterias vivas atenuadas como vehículos para administrar ácidos nucleicos (Paglia et al., 2000; Weiss y Chakraborty 2001; Yuhua et al., 2001) , que pueden codificar inhibidores angiogénicos (Lee et al., 2005a; 2005b; Li et al., 2003) , enzimas convertidoras de profármacos (King et al., 2002) o citocinas (Yamada et al., 2000) . Los inconvenientes significativos de este planteamiento incluyen (a) las bacterias recombinantes vivas pierden gradualmente el ADN plasmídico in vivo, principalmente debido a la ausencia de la presión de selección y la segregación de plásmidos asociada, (b) las bacterias portadoras de ADN plasmídico tienden a tener una velocidad de crecimiento menor y parece que se acumulan a menores concentraciones y residen durante un periodo de tiempo más corto dentro de los tumores que las bacterias sin plásmidos, (c) los vectores bacterianos gramnegativos vivos pueden provocar una respuesta de endotoxinas grave en huéspedes mamíferos, posiblemente debido a la liberación in vivo de endotoxinas (lipopolisacárido; LPS) , y evocan una respuesta de receptores de tipo Toll debido a la invasión celular, (d) la mayoría de las bacterias vivas dirigidas a tumores se acumulan y crecen en los focos necróticos y relativamente hipóxicos dentro de los tumores, pero no en tumores bien oxigenados en el borde de los nódulos en crecimientos donde normalmente son más agresivas las células tumorales, (e) el riesgo asociado con la posible inversión a un fenotipo virulento de estas bacterias es una gran preocupación (Dunham, 2002) y (f) el riesgo de infectar células sanas puede dar lugar a una bacteremia y el choque séptico asociado. Esto último puede ser un problema en particular en pacientes inmunodeprimidos, tales como pacientes con cáncer avanzado.

Debido a que los problemas siguen impidiendo el éxito de los tratamientos... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende (I) una pluralidad de células bacterianas muertas intactas, pluralidad de la que cada célula bacteriana muerta posee una pared celular y/o membrana celular intacta, que contienen material genético que es endógeno de la especie bacteriana, y que engloba (i) un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto, tal como un péptido, un polipéptido o una proteína, cuya producción se desea en una célula objetivo, (ii) un fármaco que es una sustancia fisiológica o farmacéuticamente activa que produce un efecto local o sistémico deseado en mamíferos y seres humanos o (iii) una molécula de ácido nucleico funcional, que tras la introducción en una célula huésped, interfiere específicamente con la expresión de una proteína, (II) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas y (III) un ligando biespecífico unido a cada célula bacteriana muerta intacta.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichas células bacterianas muertas contienen ácido nucleico funcional.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho ácido nucleico funcional no tiene plásmidos.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichas células bacterianas muertas contienen un fármaco.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige el transcrito de una proteína que promueve la resistencia a fármacos, inhibe la apoptosis o promueve un fenotipo neoplásico.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico funcional es un ARNip, un ARNhc o un ARNmi que se dirige al transcrito de una proteína que promueve la resistencia a fármacos.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige al transcrito de la P-glucoproteína, MDR-2 o MDR-3.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige al transcrito de MRP2, BCR-ABL, la proteína asociada a la resistencia STI-571, la proteína relacionada con la resistencia pulmonar, la ciclooxigenasa-2, el factor nuclear kappa, XRCC1, ERCC1, GSTP1, la β-tubulina mutante o un factor de crecimiento.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige al transcrito de una proteína que inhibe la apoptosis.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige a un transcrito de Bcl-2, Bcl-XL, A1/Bfl 1, la cinasa de adhesión focal o la proteína p53.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige a un transcrito de una proteína que promueve un fenotipo neoplásico.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho ácido nucleico funcional se dirige a un transcrito de β-catenina, PKC-α, C-RAF, K-Ras, la secuencia DEAD DP97 de la helicasa de ARN, DNMT1, FLIP, C-Sfc, 53BPI, la proteína del grupo Polycomb EZH2, ErbB1 HPV-16 E5 y E7, Fortilin y MCI1P, DIP13α, MBD2, p21, KLF4, tpt/TCTP, SPK1 y SPK2, P300, PLK1, Trp53, Ras, ErbB1, VEGF o BAG-1.

13. La composición de la reivindicación 5, que comprende además un fármaco.

14. La composición de la reivindicación 13, en la que dicho fármaco se introduce en una célula bacteriana muerta.

15. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

16. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un polipéptido o un hidrato de carbono.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un primer brazo portador de la especificidad por una estructura de superficie de célula bacteriana y un segundo brazo portador de la especificidad por un receptor de superficie de célula de mamífero no fagocítica.

18. Un procedimiento de carga de células bacterianas muertas intactas con un fármaco que comprende la etapa de crear un gradiente de concentración de dicho fármaco entre un medio extracelular que contiene dichas células bacterianas muertas intactas y el citoplasma de las célula bacteriana muerta intacta, de modo que dicho fármaco se desplaza a favor de dicho gradiente de concentración y se introduce en el citoplasma de la célula bacteriana muerta

intacta, en el que cada célula bacteriana muerta posee una pared celular y/o membrana celular intacta y contiene material genético que es endógeno de la especie bacteriana.

19. Un procedimiento de carga de células bacterianas muertas con un fármaco, que comprende las etapas de: 5

(a) cultivar una célula bacteriana en condiciones tales que la célula bacteriana transcriba y traduzca un ácido nucleico terapéutico que codifica dicho fármaco, de modo que se libere dicho fármaco en el citoplasma de dicha célula bacteriana, y a continuación (b) destruir dicha célula bacteriana para formar una o más células bacterianas muertas que contienen dicho fármaco en el citoplasma,

en el que cada célula bacteriana muerta posee una pared celular y/o membrana celular intacta y contiene material genético que es endógeno de la especie bacteriana.

20. Un procedimiento para formular una célula bacteriana muerta de la composición de la reivindicación 3, que comprende coincubar una pluralidad de células bacterianas muertas intactas con ácido nucleico funcional en un tampón.