Un método de purificación que comprende someter una muestra enriquecida en minicélulas a una condición que induce que las células bacterianas parentales adopten una forma filamentosa y después filtrar dicha muestra,

produciendo una composición purificada de minicélulas

Método farmacéuticamente compatible para purificar minicélulas bacterianas intactas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un método farmacéuticamente compatible para purificar minicélulas bacterianas intactas.

Una minicélulas es una forma anucleada de una E. coli u otra célula bacteriana, engendrada por una alteración en la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con la segregación de ADN. La replicación cromosómica procariota está unida a la fisión binaria normal, que implica la formación de un septo en mitad de la célula. Por ejemplo, en E. coli, la mutación de los genes min, tal como minCD, puede eliminar la inhibición de la formación del septo en los polos celulares durante la división celular, lo que resulta en la producción de una célula hija normal y una minicélula anucleada (de Boer et al., 1992; Raskin & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 2001).

Además de las mutaciones en el operón min, las minicélulas anucleadas también se generan siguiendo una gama de otras reorganizaciones o mutaciones genéticas que afectan a la formación del septo, por ejemplo en el divIVB1 en B. subtilis (Reeve y Cornett, 1975; Levin et al., 1992). Las minicélulas también se pueden formar después de una alteración en los niveles de la expresión génica de proteínas implicadas en la división celular/segregación cromosómica. Por ejemplo, la sobreexpresión de minE produce división polar y la producción de minicélulas. De forma similar, las minicélulas sin cromosoma pueden provenir de defectos en la segregación cromosómica, por ejemplo la mutación smc en Bacillus subtilis (Britton et al., 1998), la deleción spoOJ en B. subtilis (Ireton et al., 1994), la mutación mukB en E. coli (Hiraga et al., 1989) y la mutación parC en E. coli (Stewart y D'Ari, 1992). Los productos génicos se pueden suministrar en trans. Cuando se sobreexpresa de un plásmido de alto número de copia, por ejemplo, CafA puede aumentar la velocidad de división celular y/o inhibir el reparto cromosómico después de la replicación (Okada et al., 1994), lo que produce la formación de células encadenadas y minicélulas anucleadas (Wachi et al., 1989; Okada et al., 1993).

Las minicélulas son diferentes de otras pequeñas vesículas que se generan y liberan de forma espontánea en ciertas situaciones y, al contrario que las minicélulas, no se deben a reorganizaciones genéticas específicas o expresión génica episomal. Ejemplares de tales otras vesículas son ampollas bacterianas que son pequeñas vesículas de membrana (Dorward et al., 1989). Se han observado las ampollas en varias especies de bacterias desde Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Escherichia, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Shigella, por ejemplo. Las ampollas bacterianas se pueden producir, por ejemplo, mediante manipulación del entorno de crecimiento (Katsui et al., 1982) y mediante el uso de agentes exógenos que desestabilizan la membrana (Matsuzaki et al., 1997).

Puesto que la replicación de plásmidos en células procariotas es independiente de la replicación cromosómica, los plásmidos pueden segregar tanto en células hijas normales como minicélulas durante la división celular anómala descrita anteriormente. De esta manera, las minicélula derivadas de E. coli min^- recombinantes tienen números significativos de copias de plásmidos, con todos los componentes celulares bacterianos excepto cromosomas y se han usado como tales para estudiar expresión de genes codificados en plásmidos in vitro. Véase Brahmbhatt (1987), Harlow et al., (1995) y Kihara et al., (1996). Brahmbhatt (1987) demostró, por ejemplo, que las miniclélulas de E. coli pueden tener plásmidos recombinantes con insertos de ADN tan grandes como de 20 kb, ausente cualquier ADN cromosómico, y pueden expresar nueve o más proteínas recombinantes de forma simultánea.

Una publicación de patente reciente, WO03033519, describe minicélulas recombinantes intactas que contienen moléculas de ácido nucleico terapéutico. Tales minicélulas son vectores eficaces para distribuir oligonucleótidos y polinucleótidos a células huésped in vitro e in vivo. Según esto, son particularmente útiles para introducir moléculas de ácido nucleico que, tras la transcripción y/o traducción, funcionan para mejorar o tratar de otra manera una enfermedad o modificar un rasgo asociado con un tipo celular, tejido u órgano particular de un sujeto.

Khachatourians et al., (1973) describe un método para preparar minicélulas en donde las bacterias contaminantes presentes en cultivos de minicélulas después de centrifugación diferencial a baja velocidad se transforman en células filamentosas largas y se matan mediante tratamiento sónico.

Las aplicaciones de minicélulas in vivo en general requieren preparaciones de minicélulas de alta pureza, particularmente con respecto a bacterias parentales vivas, sin endotoxina y restos celulares (incluyendo bacterias parentales vivas, fragmentos de membrana, ácidos nucleicos y componentes intracelulares) que podrían provocar una respuesta inflamatoria en un huésped inmunizado. Además, el uso de minicélulas en productos farmacéuticos comerciales requerirá métodos de purificación de las minicélulas según estándares farmacéuticos internacionales aprobados. Para este fin, los métodos convencionales de purificación de minicélulas son en general insatisfactorios.

Las técnicas convencionales implican (a) centrifugación a baja velocidad, para reducir la carga biológica de células parentales y (b) sedimentación a velocidad diferencial en un gradiente de glicerol, sacarosa o percoll. Una centrifugación diferencial inicial a baja velocidad típicamente reduce las células parentales en tanto como 100 veces, mientras que deja del 50% al 70% de las minicélulas en el líquido sobrenadante. Dos ciclos posteriores de sedimentación a velocidad diferencial producen después preparaciones de minicélulas que tienen una pureza de alrededor de 1 célula vegetativa por 10⁶-10⁷ minicélulas. Tales métodos convencionales se revisan en Frazer & Curtiss (1975) y se describen en Reeve (1979), Clark-Curtiss & Curtiss (1983) y la patente de EE. UU. No. 4311797 (a Khachatourians).

La pureza alcanzada mediante los métodos convencionales de purificación puede no ser adecuada para todas las aplicaciones in vivo, algunas de las cuales pueden requerir dosis mayores de 10⁶ minicélulas o incluso 10¹⁰ minicélulas. A la relación de contaminación anteriormente mencionada, esto se traduciría en 10.000 células parentales vivas por dosis. Tal nivel de contaminación podría ser letal, particularmente en pacientes inmunodeprimidos tales como pacientes de cáncer y SIDA. Por ejemplo, la DI₅₀ (dosis infecciosa en el 50% de las personas infectadas) para organismos de Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis y Listeria monocytogenes es aproximadamente 10, 1.000 y 10 respectivamente. Además, estudios previos han descrito que el nivel de contaminación celular parental varía con diferentes cepas bacterianas (Clarke-Curtiss y Curtiss, 1983). A ese respecto, las aplicaciones de terapia génica descritas en WO03033519 pueden emplear minicélulas derivadas de una gama de cepas bacterianas mutantes Gram negativas y Gram positivas y requerirían minicélulas que están esencialmente libres de contaminación de células bacterianas parentales vivas. De esta manera, los métodos convencionales de purificación de minicélulas no permiten control de calidad para la fabricación cGMP (buena práctica de fabricación actual, en sus siglas en inglés) de dosis biofarmacéuticas de minicélulas.

Como desventaja adicional, los medios de formación del gradiente (percoll, sacarosa y glicerol) empleados por los métodos convencionales de purificación son incompatibles con usos in vivo. El percoll es tóxico y, por lo tanto, está restringido a contextos de "solo fines de investigación". La sacarosa da una gran osmolaridad a los gradientes que puede producir cambios fisiológicos en la minicélulas. En efecto, los presentes inventores han determinado que las minicélulas experimentan un choque osmótico en gradientes de sacarosa y, como consecuencia, de vuelven estructuralmente deformadas....

1. Un método de purificación que comprende someter una muestra enriquecida en minicélulas a una condición que induce que las células bacterianas parentales adopten una forma filamentosa y después filtrar dicha muestra, produciendo una composición purificada de minicélulas.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha condición es una condición osmótica, una condición anaeróbica o una condición de limitación de nutrientes, que inducen estrés.

3. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha muestra se incuba en un medio hipertónico.

4. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración es una filtración frontal con un filtro que emplea un tamaño de poro de alrededor de 0,45 µm.

5. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración emplea un filtro que tiene un tamaño de poro lo suficientemente pequeño para permitir que las minicélulas pasen a través de los poros, pero no las células bacterianas parentales filamentosas.

6. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración comprende filtración de flujo transversal.

7. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración comprende un proceso de filtración en serie que combina filtración de flujo transversal y filtración frontal.

8. Un método según la reivindicación 7, en donde el paso de filtración emplea al menos un filtro que emplea un tamaño de poro menor que o igual a alrededor de 0,2 µm.

9. Un método según la reivindicación 7, en donde el paso de filtración emplea al menos un filtro que emplea un tamaño de poro mayor que o igual a alrededor de 0,45 µm.

10. Un método según la reivindicación 7, en donde dicho proceso de filtración en serie está precedido por centrifugación diferencial.

11. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración emplea al menos un filtro que emplea un tamaño de poro menor que o igual a alrededor de 0,2 µm.

12. Un método según la reivindicación 1, en donde el paso de filtración emplea al menos un filtro que emplea un tamaño de poro mayor que o igual a alrededor de 0,45 µm.

13. Un método según la reivindicación 1, que además comprende un paso de someter las minicélulas a centrifugación en gradiente de densidad.

14. Un método según la reivindicación 13, que además comprende un paso de someter las minicélulas a centrifugación diferencial.

15. Un método según la reivindicación 13, en donde dicho medio es isotónico y no tóxico.

16. Un método según la reivindicación 13, en donde dicho medio consiste esencialmente en yodixanol y agua.

17. Un método según la reivindicación 1, que además comprende un paso de tratar dicha composición purificada de minicélulas con un antibiótico.

18. Un método según la reivindicación 1, que comprende además un paso de eliminar la endotoxina libre de dicha composición purificada de minicélulas.

19. Un método según la reivindicación 18, en donde dicho paso de eliminar la endotoxina libre emplea anticuerpos anti-lípido A.

20. Una preparación purificada de minicélulas, obtenible según el método de la reivindicación 1, que contiene menos de alrededor de 1 célula bacteriana parental contaminante por 10¹⁰ minicélulas, en donde el paso de filtración de dicho método comprende un proceso de filtración en serie que combina filtración de flujo transversal y filtración frontal, en donde dicho proceso de filtración en serie está precedido por centrifugación diferencial y dicho método comprende además un paso de someter las minicélulas a centrifugación en gradiente de densidad.

21. Una preparación purificada de minicélulas, obtenible según el método de la reivindicación 1, que contiene menos de alrededor de 1 célula bacteriana parental contaminante por 10¹¹ minicélulas, en donde el paso de filtración de dicho método comprende un proceso de filtración en serie que combina filtración de flujo transversal y filtración frontal, en donde dicho proceso de filtración en serie está precedido por centrifugación diferencial y dicho método comprende además un paso de someter las minicélulas a centrifugación en gradiente de densidad.