Minicélulas intactas como vectores para transferencia de ADN y terapia génica in vitro e in vivo.

Una composición que comprende (i) minicélulas bacterianas intactas recombinantes y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas,

en la que dichas minicélulas bacterianas intactas contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, y en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0,2 μm o menos de tamaño

Minicélulas intactas como vectores para transferencia de ADN y terapia génica in vitro e in vivo Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a la administración, por medio de minicélulas bacterianas intactas, de oligonucleótidos y polinucleótidos a células huésped, particularmente, pero no exclusivamente, en el contexto de terapia génica. La invención también se refiere a un procedimiento farmacéuticamente compatible para purificar minicélulas bacterianas intactas.

Una patente de EE.UU. concedida a Salser y col., nº 4.497.796, esclarece diversos enfoques tempranos disponibles en aproximadamente 1980 para transformar células de mamífero. En particular, Salser y col. desvelan la transferencia de un gen que codifica dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia a metrotrexato, a células L1210 de ratón o células de la médula ósea, por la técnica de co-precipitación de ADN con fosfato de calcio.

Salser y col. también mencionan "[otras] varias formas ... para la inserción de materiales genéticos en células" que incluyen, además de "vectores víricos", ciertas técnicas de fusión de células: "fusión célula-célula que implica la fusión de células de un número limitado de cromosomas envueltos en membranas nucleares;... fusión de minicélulas;...fusión con protoplastos bacterianos que contienen ADN de plásmido; y fusión con fantasmas de eritrocitos encapsidados con ADN" (columna 5, líneas 18 - 30; citas omitidas) . Común a estas técnicas es el uso de una estructura celular que contiene ADN, delimitada por una única membrana, es decir, puesta en contacto con una célula diana de mamífero en presencia de un agente promotor de la fusión de membranas tal como polietilenglicol (PEG) . La célula de mamífero y la estructura celular se fusionan, formando una célula híbrida, y el ADN contenido en esta última se libera en el citoplasma de la primera y se transporta al núcleo del híbrido, que luego puede expresar el ADN.

La divulgación de Salser menciona "fantasmas de eritrocitos", restos de eritrocitos que carecen de contenidos citoplásmicos pero que retienen la morfología original, y "protoplastos bacterianos", o células bacterianas de las que se ha despojado la membrana externa (pared celular) , normalmente por la acción de una enzima lítica o un antibiótico que inhibe la síntesis de peptidoglicanos. Salser y col. también aluden el uso de un tercer tipo de estructura celular simplificada, un protoplasto de minicélulas.

Una minicélula es una forma anucleada de una célula de E. coli u otra célula bacteriana, engendrada por una alteración en la coordinación, durante la fisión binaria, de la división celular con segregación de ADN. La replicación cromosómica procariota está ligada a fisión binaria normal, que implica formación de tabique en el centro de la célula. En E. coli, por ejemplo, la mutación de genes min, tales como minCD, puede eliminar la inhibición de la formación de tabique en los polos celulares durante la división celular, produciendo la producción de una célula hija normal y una minicélula anucleada (de Boer y col., 1992; Rapiel & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harr y , 2001) .

Además de las mutaciones del operón min, las minicélulas anucleadas también se generan siguiendo una gama de otras transposiciones o mutaciones genéticas que afectan la formación del tabique, por ejemplo, en divIVB1 en B. subtilis (Reeve y Cornett, 1975; Levin y col., 1992) . Las minicélulas también pueden formarse siguiendo una perturbación en los niveles de expresión génica de proteínas implicadas en la división celular/segregación de cromosomas. Por ejemplo, la expresión en exceso de minE conduce a división polar y producción de minicélulas. De manera similar, las minicélulas sin cromosomas pueden resultar de defectos en la segregación de cromosomas, por ejemplo, la mutación smc en Bacillus subtilis (Britton y col., 1998) , deleción de spoOJ en B. subtilis (Ireton y col., 1994) , mutación mukB en E. coli (Hiraga y col., 1989) y mutación parC en E. coli (Stewart y D'Ari, 1992) . Los productos génicos pueden suministrarse en trans. Si se expresan en exceso a partir de un plásmido de alto número de copias, por ejemplo, CafA puede potenciar la tasa de división celular y/o inhibir el reparto de cromosomas después de la replicación (Okada y col., 1994) , produciendo la formación de células encadenadas y minicélulas anucleadas (Wachi y col., 1989; Okada y col., 1993) .

Las minicélulas son distintas de otras vesículas pequeñas que se generan y se liberan espontáneamente en ciertas situaciones y, a diferencia de las minicélulas, no son debidas a transposiciones genéticas específicas o a expresión génica episómica. A modo de ejemplo de tales otras vesículas son bullas bacterianas, que son vesículas de membrana pequeñas (Dorward y col., 1989) . Se han observado bullas en varias especies bacterianas de, por ejemplo, Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Escherichia, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Shigella. Las bullas bacterianas pueden producirse, por ejemplo, por manipulación del entorno de crecimiento (Katsui y col., 1982) y mediante el uso de agentes desestabilizantes de membranas exógenas (Matsuzaki y col., 1997) .

Existen otros componentes subbacterianos tales como fantasmas bacterianos (Lubitz y col., 1999) , que son envueltas bacterianas vacías formadas en una variedad de bacterias Gram-negativas cuando el gen E de lisis phiX174 se expresa. Los fantasmas bacterianos se forman a partir de una estructura en túnel transmembrana mediante una envuelta de la célula bacteriana. Debido a la alta presión osmótica dentro de la célula, el contenido citoplásmico es expulsado al medio circundante, conduciendo a una envoltura de la célula bacteriana vacía.

Debido a que la replicación de plásmidos dentro de células procariotas es independiente de la replicación cromosómica, los plásmidos pueden segregarse tanto en células hija normales como en minicélulas durante la división celular anormal descrita anteriormente. Por tanto, las minicélulas derivadas de min E. coli recombinantes llevan números significativos de copias de plásmidos, con todos los componentes celulares bacterianos excepto los cromosomas, y se han usado como tales en estudiar la expresión génica codificada por plásmidos in vitro. Véase Brahmbhatt (1987) , Harlow y col. (1995) y Kihara y col. (1996) . Brahmbhatt (1987) demostró, por ejemplo, que las minicélulas de E. coli pueden llevar plásmidos recombinantes con insertos de ADN de hasta el 20 kb, ausente cualquier ADN cromosómico, y pueden expresar nueve o más proteínas recombinantes simultáneamente.

Tales minicélulas intactas no reproductoras, pero metabólicamente activas, se han empleado para analizar proteínas codificadas por genes transmitidos por plásmidos. En el contexto de la "fusión de minicélulas" mencionada por Salser y col., sin embargo, las minicélulas son despojadas de sus membranas externas para dar una estructura que, como un protoplasto bacteriano, puede experimentar fusión con una célula diana cuando ambas se incuban junto con PEG u otro agente que promueva la fusión celular. También al igual que los protoplastos bacterianos, tales protoplastos de minicélulas deben mantenerse bajo condiciones isotónicas con el fin de prevenir la lisis osmótica, y son altamente vulnerables al ataque enzimático. Por tanto, no son adecuados para terapia génica. Además, con la aparición de otra metodología de transformación más conveniente, la tecnología de minicélulas citada por Salser y col. cayó en desuso.

Más recientemente, la aparición de terapia génica ha puesto de relieve una variedad de procedimientos para introducir material genético exógeno en el genoma de un mamífero receptor. Véanse las revisiones por Romano y col. (1998, 1999) , Balicki y Beutler (2002) y Wadhwa y col. (2002) . La aplicación clínica de estas técnicas, tales como el uso de vectores de adenovirus o de retrovirus recombinantes, se ha retrasado debido a graves problemas de seguridad. Ahora son ilustrativos de los problemas presentados por la metodología de transformación la recombinación con virus naturales, inmunosupresión limitada inducida por virus de inserción y potencial oncogénico de los vectores víricos para llevar grandes segmentos de ADN terapéutico, reversión a virulencia de virus atenuados, dificultades en la preparación y distribución de virus recombinantes, baja estabilidad y reacciones adversas tales como una respuesta inflamatoria, producida por inmunidad existente. Un enfoque que obviara estos problemas ofrecería beneficio... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende (i) minicélulas bacterianas intactas recombinantes y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable para las mismas, en la que dichas minicélulas bacterianas intactas contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, y en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0, 2 μm o menos de tamaño.

2. Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 107 minicélulas.

3. Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 108 minicélulas.

4. Una composición según la reivindicación 1, en la que dicha composición contiene aproximadamente 1 célula parental contaminante bacteriana por 109 minicélulas.

5. Una composición que consiste esencialmente en minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en la que dicha composición está libre de contaminantes de 0, 2 μm o menos de tamaño.

6. Un procedimiento de transformación genética que comprende (i) proporcionar minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0, 2 μm o menos de tamaño y (ii) poner dicha preparación de minicélulas bacterianas intactas en contacto in vitro con células de mamífero competentes para endocitosis no fagocíticas, de forma que dichas minicélulas bacterianas son reabsorbidas por dichas células de mamífero, por lo que dichas células de mamífero producen dicho producto de expresión.

7. Un procedimiento de purificación que comprende pasar una muestra que contiene minicélulas bacterianas intactas

(i) sobre una serie de filtros de flujo cruzado y luego (ii) por un filtro frontal, por el que dichas minicélulas bacterianas intactas se separan de los contaminantes en dicha muestra para obtener una preparación de minicélulas purificadas.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7 que comprende además la etapa de tratar dicha preparación de minicélulas purificadas con un antibiótico.

9. Un procedimiento según la reivindicación 7 u 8 que comprende además una etapa preliminar de realizar centrifugación diferencial sobre dicha muestra que contiene minicélulas bacterianas.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dichas series de filtros de flujo cruzado comprenden al menos un filtro que emplea un tamaño de poro superior a o igual a aproximadamente 0, 45 μm, y al menos un filtro que emplea un tamaño de poro inferior a o igual a aproximadamente 0, 2 μm.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho filtro frontal emplea un tamaño de poro de aproximadamente 0, 45 μm.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dichas series de filtros de flujo cruzado comprenden al menos dos filtros que emplean un tamaño de poro de aproximadamente 0, 45 μm, y al menos un filtro que emplea un tamaño de poro de aproximadamente 0, 2 μm.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12 que comprende además la etapa de tratar con un antibiótico dicha preparación de minicélulas purificadas.

14. Uso de minicélulas bacterianas intactas recombinantes en la preparación de un medicamento que comprende minicélulas bacterianas intactas que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en el que dicho medicamento está libre de contaminantes de 0, 2 μm o menos de tamaño para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia

o infección o (ii) modificar una característica, por administración de dicho medicamento a una célula, un tejido o un órgano, en el que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer; (2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria y dicha característica es fertilidad.

15. Minicélulas bacterianas intactas recombinantes que contienen un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de expresión de péptido o polipéptido terapéutico, en donde dichas minicélulas bacterianas están libres de contaminantes de 0, 2 μm o menos de tamaño para su uso como un agente farmacéutico.

16. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso como agente farmacéutico.

17. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un procedimiento de (i) tratar una enfermedad, alergia o infección o (ii) modificar una característica por administración de dicha composición a una

célula, un tejido o un órgano, en la que dicha enfermedad se selecciona de (1) cáncer; (2) una enfermedad adquirida seleccionada de SIDA, neumonía y enfisema; y (3) una afección engendrada por una metabolopatía congénita, la alergia o infección se trata por modificación de una respuesta inmunitaria y dicha característica es fertilidad.