Minicélulas intactas de origen bacteriano que encierran un ácido nucleico funcional exento de plásmido para la administración in vivo a células de mamífero.

Una composición que contiene (a) una pluralidad de minicélulas intactas de origen bacteriano,

donde cada minicélula de dicha pluralidad contiene ARN regulador que está empacado en dicha minicélula y (b) un portador farmacéuticamente aceptable para ellas, donde hay una ausencia en dichas minicélulas de un constructo para la expresión in situ de dicho ARN regulador, donde dicho ARN regulador se elige del grupo que consiste en ARNip, ARNmi y ARNhc y donde dicha pluralidad contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho ARN regulador.

Minicélulas intactas de origen bacteriano que encierran un ácido nucleico funcional exento de plásmido para la administración in vivo a células de mamífero

Antecedentes de la invención

Recientemente, se desarrollaron una serie de estrategias basadas en ácidos nucleicos para modular diversas funciones celulares (Opalinska y Gewlrtz, 22). Algunas clases de ollgonucleótldos como aptámeros, oligonucleótidos señuelo que se unen a factores de transcripción, ribozimas, oligonucleótidos que forman triplex, motivos CpG inmunoestimulantes, oligonucleótidos antisentido (incluidos los ácidos nucleicos peptfdicos), ARN interferentes pequeños y microARN han despertado mucho interés como herramientas de investigación, debido a su modo altamente específico de acción. Estos ácidos nucleicos oligoméricos también tienen un potencial considerable como medicamentos. No obstante, dichos medicamentos enfrentan varios obstáculos como la Inestabilidad de los ácidos nucleicos libres y la administración celular segura, eficaz y dirigida de estas macromoléculas (Dykxhoorn y Lieberman, 25).

Un foco de muchas estrategias terapéuticas basadas en ácidos nucleicos es el fenómeno de la interferencia de ARN (ARNi), por la cual el ARN blcatenarlo (ARNbc) largo de una célula conduce a la degradación específica de la secuencia de transcritos de genes homólogos (complementarios o parcialmente complementarios). Más concretamente, las moléculas de ARNbc largo son procesadas en moléculas de ARN más pequeñas por una ribonucleasa endógena denominada "Dlcer" (Grishok et al., 2; Zamore et al., 2). Las moléculas de ARN más pequeñas se conocen como "ARN ¡nterferente pequeño" (ARNip) cuando derivan de fuentes exógenas y como "microARN" (ARNmi) cuando son producidas a partir de genes que codifican ARN en el propio genoma de la célula. Estas dos clases de ARN reguladores pequeños (por lo general, 21 a 23-nucleótidos) también difieren en que los ARNmi muestran sólo complementarledad parcial para las dianas del ARN mensajero (ARNm).

Los ARN reguladores cortos se unen al denominado "complejo de silenciamiento inducido por ARN" (RISC), que tiene una actividad de helicasa y una actividad de endonucleasa. La actividad de helicasa desenrolla las dos hebras de las moléculas de ARN, permitiendo que la hebra antisentido se una a la molécula de ARN a la que se dirige (Zamore et al., 2; Zamore, 22; Vickers et al., 23). La actividad de endonucleasa hidroliza el ARN que es la diana en el sitio donde se une la hebra antisentido.

En la ARNi, por lo tanto, una molécula de ARN monocatenario (ARNmc) se une a la molécula de ARN que es la diana según las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick y recluta una ribonucleasa que degrada el ARN que es la diana. Por el contrario, la supresión antisentido de la expresión génica conlleva la unión del ARNmc al ARNm, bloqueando la traducción, sin catalizarla degradación del ARNm.

Como clase, los ARN reguladores tienen una vida media de menos de una hora en el plasma humano (Layzer et al., 24) y son excretados rápidamente por los riñones. En consecuencia, varios grupos han intentado preparar ARN reguladores, incluidos los ARNip, que sean resistentes a las nucleasas. Ejemplos de tales esfuerzos incluyen modificar químicamente los nucleótidos (por ejemplo, 2'-F, 2'-OMe, ácidos nucleicos bloqueados; LNA) o el esqueleto fosfodiéster, por ej. uniones fosforotioato (Chiu y Rana 23; Choung et al., 26; Czauderna et al., 23; Elmén et al., 25; Layzer et al., 24; Morrissey et al., 25). Además, para minimizar el tiempo que los ARNip u otros ARN reguladores pasan en circulación, los profesionales han conjugado las moléculas de ARN a proteínas y anticuerpos para la administración dirigida a células de mamíferos deseadas. En otros esfuerzos por abordar los problemas de baja estabilidad y rápida excreción renal, los profesionales han desarrollado vehículos para la administración de ARN reguladores. También están siendo explorados poliplejos (formados por autoensamblaje de ácidos nucleicos con policationes), lipopoliplejos (formados por la condensación inicial del ácido nucleico con policationes, seguido de la adición de lipidos catiónicos), liposomas y nanopartfculas sintéticas.

Estos métodos también enfrentan numerosos obstáculos, como (a) la rápida depuración del suero de las proteínas portadoras a través de la excreción renal, (b) el limitado número de moléculas de ARN regulador que se pueden conjugar a cada proteína portadora, (c) la dificultad en la disociación intracelular de la proteína transportadora de los ARN reguladores intactos, (d) la rápida depuración debida a los poliplejos que se unen a las proteínas del suero que pueden actuar como opsoninas (Dash et al. 1999) y (e) la inestabilidad de los liposomas in vivo, que causa la liberación de ácidos nucleicos en el suero y la potencial transformación no específica.

También se han desarrollado vectores virales para producir endógenamente ARN reguladores. Véase, por ej., Devroe y Silver, 24. Sin embargo, estos vectores virales plantean serias preocupaciones de seguridad. Los problemas ilustrativos incluyen la recombinación con virus naturales, potencial oncogénico y de inserción, inmunosupresión inducida por virus, capacidad limitada de los vectores virales para acarrear grandes segmentos de ADN, reversión a la virulencia de los virus atenuados, dificultades en la fabricación y distribución, baja estabilidad y reacciones adversas (Hacein-Bey-Abina et al., 23; Kootstra y Verma, 23; Raper et al., 23; Verma y Weitzman,

25; Check, 25).

También se han desarrollado sistemas basados en plásmidos para la expresión recombinante, in situ de un ARN regulador, como un ARNip o un precursor más grande (~ 7 nt), un ARN horquillado corto (ARNhc). Un ARNhc contiene secuencias sentido y antisentido de un gen que es la diana que están conectadas por un bucle en horquilla. Véase, por ej., Paddison et al., 22. Los ARNhc se pueden expresar a partir de un promotor tipo pol III o en el contexto de un ARNmi, mediante promotores pol II.

Como se describe en la solicitud internacional WO 3/33519, los plásmidos que codifican un ARNhc, ARNip u otro ARN regulador se pueden transformar en una cepa bacteriana progenitora que produzca minicélulas intactas, en virtud de una mutación que cause la división celular asimétrica. Dicha transformación produce bacterias recombinantes en las cuales el plásmido se replica intracelularmente, introduciendo gran cantidad de plásmidos en el citoplasma bacteriano. Durante la división asimétrica, algunos de los plásmido se segregan en el citoplasma minicelular originando minicélulas recombinantes. Después las minicélulas pueden administrar el ADN plasmídico a una célula de mamífero, en la que el ADN plasmídico migra hacia el núcleo celular. En el núcleo el ADN plasmídico expresa el ARNhc u otro ARN regulador, según sea el caso, y el ácido nucleico resultante migra luego al citoplasma, donde puede efectuar ARNi o supresión génica, dependiendo de la naturaleza del ARN regulador involucrado.

Sin embargo, debido a que estos métodos requieren maquinaria hospedadora, administrar cantidades terapéuticamente eficaces de ácido nucleico mediante sistemas basados en la expresión, implica procesos complejos y prolongados que limitan su eficacia. Por consiguiente, es necesaria una metodología más eficaz para la administración de ácidos nucleicos funcionales, como los ARN reguladores, para la administración dirigida a células.

WO/26/21894 describe la administración de moléculas de ARN a células de mamífero mediante minicélulas de origen bacteriano. Más específicamente, los ejemplos dan a conocer plásmidos, que codifican una secuencia de ARN, que fueron transformados en células bacterianas. Las células bacterianas recombinantes resultantes engendraron minicélulas que recibieron los plásmidos, y las minicélulas que contenían los plásmidos fueron a su vez absorbidas por células de mamífero, en las cuales se liberaron los plásmidos dando lugar a la transcripción de la secuencia de ARN en las células de mamífero.

Resumen de la invención

Por consiguiente, de conformidad con un aspecto de la invención, una composición que contiene (a) una pluralidad de minicélulas intactas, de origen bacteriano, en donde cada minicélula de dicha pluralidad contiene ARN regulador que está empacado en dichas minicélulas y (b) un portador farmacéuticamente aceptable para ellas, donde hay una ausencia en dichas minicélulas de un constructo para la expresión in situ de dicho ARN regulador, donde dicho ARN regulador se elige del grupo que consiste en ARNip, ARNmi y ARNhc y donde dicha pluralidad contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de... [Seguir leyendo]

1. Una composición que contiene (a) una pluralidad de minicélulas intactas de origen bacteriano, donde cada minicélula de dicha pluralidad contiene ARN regulador que está empacado en dicha mlnlcélula y (b) un portador farmacéuticamente aceptable para ellas, donde hay una ausencia en dichas mlnlcélulas de un constructo para la expresión in situ de dicho ARN regulador, donde dicho ARN regulador se elige del grupo que consiste en ARNIp, ARNmi y ARNhc y donde dicha pluralidad contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho ARN regulador.

2. La composición de la reivindicación 1, donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito de ARN que codifica una proteína que contribuye a la resistencia a los fármacos, la resistencia a la apoptosls o la neoplastlcldad.

3. La composición de la reivindicación 1, donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito de: la glucoprotefna P, MDR-2 o MDR-3.

4. La composición de la reivindicación 1, donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito de: MRP2, BCR-ABL, la proteína asociada a la resistencia a STI-571, una proteína relacionada a la resistencia pulmonar, la clclooxlgenasa-2, el factor nuclear kappa, XRCC1, ERCC1, GSTP1, la (3-tubullna muíante, o un factor de crecimiento.

5. La composición de la reivindicación 1, donde dicho RNA regulador se dirige al transcrito de Bcl-2, Bcl-XL, A1/Bfl 1, la cinasa de adhesión focal o la proteína p53.

6. La composición de la reivindicación 1, donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito de la (3-Catenlna, PKC-a, C-RAF, K-Ras, la ARN helicasa Dead box DP97, cdk1, DNMT1, FLIP, C-Sfc, 53BPI, la proteína del grupo Polycomb EZH2, ErbB1, HPV-16 E5 y E7, Fortilln & MCI1P, KSP, DIP13a, MBD2, p21, KLF4, tpt/TCTP, SPK1 & SPK2, P3, PLK1, Trp53, Ras, ErbB1, VEGF o BAG-1.

7. La composición de la reivindicación 1, que contiene además un fármaco.

8. La composición de la reivindicación 7, donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito que codifica una proteína que contribuye a la resistencia a dicho fármaco.

9. La composición de la reivindicación 8, donde dicho fármaco está empacado en una minicélula Intacta de origen bacteriano.

1. La composición de la reivindicación 9, donde dicho ARN regulador y dicho fármaco están empacados en la misma minicélula.

11. La composición de la reivindicación 1, que contiene además un ligando biespecífico.

12. La composición de la reivindicación 11, donde dicho ligando biespecífico contiene un primer brazo que tiene especificidad por una estructura de superficie de una minicélula y un segundo brazo que tiene especificidad por un receptor de superficie de una célula de mamífero no fagocítica.

13. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 12, donde dicho ARN regulador es ARNip.

14. La composición de la reivindicación 12, donde dicho receptor de la superficie de la célula de mamífero es capaz de activar la endocitosis mediada por receptor de dicha minicélula.

15. La composición de la reivindicación 11, donde dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

16. La composición de la reivindicación 1, donde dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana progenitora contaminante cada 19 minicélulas.

17. La composición de la reivindicación 1, donde dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana progenitora contaminante cada 11° minicélulas.

18. La composición de la reivindicación 1, donde dicha composición contiene menos de aproximadamente 1 célula bacteriana progenitora contaminante cada 111 minicélulas.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 para utilizar como un medicamento.

2. La composición de la reivindicación 19, donde dicho ARN regulador es ARNhc.

21. La composición de la reivindicación 19, donde dicho ARN reguladores ARNip.

22. La composición de la reivindicación 19 para utilizar en el tratamiento de la resistencia a los fármacos o la resistencia a la apoptosis.

23. La composición de la reivindicación 19 para usar en el tratamiento del cáncer o la neoplasticidad, que contiene además un ligando biespecífico, donde dicho ligando biespecífico contiene un primer brazo que tiene especificidad por una estructura de superficie de una minicélula y un segundo brazo que tiene especificidad por un receptor de superficie de una célula de mamífero no fagocítica.

24. La composición de la reivindicación 23, donde dicho cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de vías urinarias, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer epitelial colónico.

25. La composición de la reivindicación 19, donde dicho medicamento está destinado al uso en combinación con un fármaco donde dicho ARN regulador se dirige al transcrito de una proteína que contribuye a la resistencia a dicho fármaco.

26. La composición de la reivindicación 25, donde dicho fármaco se empaca en una minicélula intacta de origen bacteriano.

27. La composición de la reivindicación 26, donde dicho ARN regulador y dicho fármaco están empacados en la misma minicélula.

28. Un método para formular minicélulas de la composición de la reivindicación 1, que comprende coincubar en un tampón (A) una pluralidad de minicélulas intactas, de origen bacteriano con (B) ARN regulador exento de plásmido, obteniendo así minicélulas que contienen dicho ARN regulador, donde dicho ARN regulador se elige del grupo que consiste en ARNip, ARNmi y ARNhc.

29. El método de la reivindicación 28, donde dicho ARN regulador es ARNhc.

3. El método de la reivindicación 28, donde dicho ARN regulador es ARNip.

31. El método de la reivindicación 29, donde la cantidad de ARNip presente en dichas minicélulas que contienen dicho ARNip es tal que 11 minicélulas empacan al menos aproximadamente 1.3 pg de ARNip.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, donde dicha incubación se lleva a cabo en solución salina tamponada.