Una composición que comprende (i) una minicélula derivada de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico terapéutica y (ii) un ligando biespecífico que es capaz de unirse a un componente de superficie de dicha minicélula y a un componente de superficie de una célula de mamífero no fagocítica,

en la que dicho ligando biespecífico tiene especificidad por un receptor de superficie de célula de mamífero capaz de activar endocitosis mediada por receptor

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/527.764, presentada el 9 de diciembre de 2003.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y a composiciones para dirigir vectores minicelulares bacterianos a células huésped no fagocíticas, particularmente pero no exclusivamente en el contexto de terapia génica. La invención emplea moléculas biespecíficas que se unen específicamente tanto a una estructura de superficie de minicélula como a una estructura de superficie de célula huésped, tal como un receptor. Mediando una interacción entre los vectores de minicélula y las células huésped no fagocíticas, los ligandos biespecíficos permiten la administración dirigida de oligonucleótidos y polinucleótidos a las células huésped.

El objetivo de la terapia génica es insertar uno o más genes ajenos en las células de un organismo para inactivar un gen, reemplazar un gen defectuoso o expresar un producto génico que proporciona un efecto profiláctico o terapéutico. Avances recientes en terapia génica han destacado una diversidad de métodos para introducir genes ajenos en el genoma de animales receptores. Véase, Romano y col. 1998, 1999; Balicki y Beutler, 2002; Wadhwa y col., 2002; y Thomas y col., 2003. Estos avances se refieren al uso de vectores virales, tanto humanos como no humanos y vectores no virales, tales como complejos de ADN-liposoma.

Aunque cada sistema de vector tiene sus ventajas, cada uno tiene también inconvenientes significativos que han limitado cualquier aplicación clínica. En particular, los vectores virales plantean preocupaciones de seguridad graves, incluyendo la recombinación con virus de tipo silvestre, potencial de inserción y oncogénico, toxicidad intrínseca de vectores de virus animales a células de mamífero, inmunosupresión inducida por virus, inversión a virulencia de virus atenuados y reacciones secundarias tales como una respuesta inflamatoria provocada por inmunidad existente. Los vectores virales también presentan problemas prácticos, tales como dificultades en la preparación y distribución de virus recombinantes, estabilidad baja y capacidad limitada de los vectores de portar grandes cantidades de ADN exógeno. Los vectores no virales tienen los inconvenientes de ser generalmente menos eficaces en la administración génica.

Abordando estos inconvenientes, el documento PCT/IB02/04632 ha descrito minicélulas intactas recombinantes que contienen moléculas de ácido nucleico terapéuticas. Tales minicélulas son vectores eficaces para administrar oligonucleótidos y polinucleótidos a células huésped in vitro e in vivo. El documento PCT/IB02/04632 ha demostrado, por ejemplo que minicélulas recombinantes que portan plásmidos de expresión de genes de mamífero se podrían administrar a células fagocíticas, tales como macrófagos y a células no fagocíticas, ilustradas por células de cáncer mamario humano. La solicitud también demostró que la administración intraperitoneal de las minicélulas recombinantes dio como resultado la administración de plásmidos recombinantes a células fagocíticas del sistema inmune y que se pudo provocar una respuesta de anticuerpo en suero a la proteína codificada.

Aunque la eficacia de la administración génica a células fagocíticas a través de minicélulas es elevada (40-60%), la eficacia de administración génica a células no fagocíticas hasta ahora ha sido comparativamente baja (3% al 5%). Se esperaría que esto limite gravemente las aplicaciones clínicas, debido a que muchas indicaciones potenciales para terapia génica implican células endoteliales y otras células no fagocíticas. La mayoría de los cánceres, por ejemplo, no son de células fagocíticas y no se podría esperar que los vectores que carecen de especificidad de célula o de órgano pudieran emplearse eficazmente para tratar tales cánceres.

Una carencia de especificidad similar también ha obstaculizado la aplicación de vectores de no minicélula y diversos enfoques se están desarrollando para abordar este problema. Véase, Wickham, 2003. Un enfoque aprovecha el sistema de endocitosis mediado por receptor (EMR), presente en muchos tipos celulares e implica el desarrollo de un conjunto diverso de ligandos de dirección. En este enfoque, la especificidad de célula se imparte al vector enlazando al mismo un ligando que se dirige a un receptor o marcador en la superficie celular específico. A continuación de la unión específica, el sistema de EMR de células diana se activa y el complejo vector/receptor se internaliza y se digiere, transportándose algo de la carga útil de ADN al núcleo para expresión génica. Algunos receptores celulares pueden ser capaces de facilitar la captación de vector en el citoplasma directamente a través de la membrana plasmática (Fernandez y Bailey, 1998; Phelan y col., 1998; Rojas y col., 1998), pero la vía más común para la captación mediada por receptor de restos macromoleculares es la ruta de tráfico endocítico (Conner y Schmid, 2003).

Existen varios desafíos con respecto a la administración génica dirigida a células de mamífero no fagocíticas: (i) traspasar la membrana plasmática de las células de mamífero; (ii) explotar un mecanismo de administración de internalización de vector; (iii) seleccionar y comprender la naturaleza de ligandos de dirección usados para dirigirse a receptores de superficie de células de mamífero específicos; (iv) conseguir la degradación intracelular del vector de administración sin la degradación completa de la carga útil de ADN; y (v) obtener la liberación y el transporte de la carga útil de ADN al citoplasma o núcleo de la célula de mamífero. Estos desafíos varían en algún grado con cada vector de administración génica. A pesar de la investigación exhaustiva en el campo, el conocimiento detallado de los procedimientos biológicos implicados es aún rudimentario.

La dirección basada en ligando de células bacterianas o cualquier partícula de origen bacteriano hacia células no fagocíticas no se ha informado, probablemente debido a que (a) únicamente los patógenos intracelulares bacterianos vivos pueden entrar en células no fagocíticas, aunque esto se consiga mediante un procedimiento de invasión activo (es decir, la entrada en células no fagocíticas se cree que es un procedimiento de invasión activo que requiere un procedimiento activado por energía multicomponente realizado por patógenos bacterianos vivos) y (b) la invasión celular activa anularía un procedimiento pasivo tal como endocitosis mediada por receptor basada en ligando. Por tanto, las células bacterianas muertas no participarían en invasión celular activa y las células bacterianas vivas no se dirigirían, al contrario de su tropismo natural, hacia células no fagocíticas deseadas. Incluso si la dirección basada en ligando se empleara para posibilitar la endocitosis de células bacterianas muertas o partículas no vivas de origen bacteriano, el procedimiento no se esperaría que fuera eficaz para administración génica. En lugar de ello, se esperaría que los endosomas degradaran las células no vivas o partículas, haciéndolas ineficaces como vectores de administración génica. A este respecto, actualmente se piensa que únicamente las bacterias patógenas intracelulares facultativas vivas pueden expresar proteínas que permiten el escape de la membrana endosómica.

Hasta la fecha, no existe una metodología probada para dirigir eficazmente vectores de minicélulas bacterianas a células huésped de mamífero no fagocíticas, para administrar de ese modo una carga útil de genes. Aunque se conoce una diversidad de tecnologías de dirección de vector, el adoptar sencillamente cualquiera de ellas no da como resultado predecible una administración génica dirigida por minicélula satisfactoria. Esto se debe a la variedad de factores biológicos, únicos para cada vector de administración génica, que pueden influir en la administración génica dirigida

Por lo tanto, existe una necesidad de un procedimiento para dirigir específicamente vectores de minicélulas bacterianos a células de mamífero no fagocíticas.

Sumario de la invención

Para abordar éstas y otras necesidades, la presente invención proporciona, de acuerdo con un aspecto,

una composición que comprende (i) minicélulas obtenidas de bacterias que contienen un ácido nucleico terapéutico y (ii) ligandos biespecíficos que son capaces de unirse a un componente... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende (i) una minicélula derivada de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico terapéutica y (ii) un ligando biespecífico que es capaz de unirse a un componente de superficie de dicha minicélula y a un componente de superficie de una célula de mamífero no fagocítica, en la que dicho ligando biespecífico tiene especificidad por un receptor de superficie de célula de mamífero capaz de activar endocitosis mediada por receptor.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende polipéptido o carbohidrato.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un primer brazo que porta especificidad por una estructura de superficie de minicélula obtenida de bacterias y un segundo brazo que porta especificidad por un receptor de superficie de célula de mamífero no fagocítica.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho primer brazo y dicho segundo brazo son monoespecíficos.

5. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho primer brazo y dicho segundo brazo son multivalentes.

6. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha estructura de superficie de minicélula es un componente de polisacárido O de un lipopolisacárido en dicha superficie de minicélula.

7. La composición de la reivindicación 3, en la que dicha estructura de superficie de minicélula es un miembro del grupo que consiste en proteínas de membrana exterior, pili, fimbrias, flagelos y carbohidratos expuestos en la superficie celular.

8. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho receptor de superficie de célula de mamífero es capaz de activar endocitosis mediada por receptor de dicha minicélula.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

10. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo humanizado.

11. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha minicélula comprende una pared celular intacta.

12. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico terapéutica codifica un gen suicida.

13. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico terapéutico codifica un equivalente normal de un gen que expresa una proteína que funciona anormalmente o está presente en niveles anormales en dicha célula de mamífero.

14. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico terapéutico está contenido en un plásmido comprendido de múltiples secuencias de ácido nucleico.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que plásmido comprende un elemento regulador.

16. La composición de la reivindicación 14, en la que dicho plásmido comprende un elemento informador.

17. Uso de una composición como se define en la reivindicación 1 en la preparación de medicamento para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o modificar un rasgo mediante la administración de dicho medicamento a una célula, tejido u órgano.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho ligando biespecífico comprende polipéptido o carbohidrato.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho ligando biespecífico comprende un primer brazo que porta especificidad por una estructura de superficie de minicélula obtenida de bacterias y un segundo brazo que porta especificidad por un receptor de superficie de célula de mamífero no fagocítica.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho primer brazo y dicho segundo brazo son monoespecíficos.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho primer brazo y dicho segundo brazo son multivalentes.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha estructura de superficie de minicélula es un componente de polisacárido O de un lipopolisacárido en dicha superficie de minicélula.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha estructura de superficie de minicélula es un miembro del grupo que consiste en proteínas de membrana exterior, pili, fimbrias, flagelos y carbohidratos expuestos en la superficie celular.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho receptor de superficie de célula de mamífero es capaz de activar endocitosis mediada por receptor de dicha minicélula.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho ligando biespecífico comprende un anticuerpo humanizado.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha minicélula comprende una pared celular intacta.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha secuencia de ácido nucleico terapéutica codifica un gen suicida.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico terapéutico codifica un equivalente normal de un gen que expresa una proteína que funciona anormalmente o que está presente en niveles anormales en dichas células de mamífero.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichas células de mamífero están in vitro.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichas células de mamífero están in vivo.

32. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico terapéutico está contenido en un plásmido que comprende múltiples secuencias de ácido nucleico.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el que dicho plásmido comprende un elemento regulador.

34. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el que dicho plásmido comprende un elemento informador.

35. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho receptor de superficie de célula de mamífero se expresa de manera elevada en la superficie de dichas células de mamífero no fagocíticas.

36. La composición de la reivindicación 1, en la que dichas moléculas de ácido nucleico son plásmidos y cada una de dichas minicélulas contiene más de 60 copias de dicho plásmido.

37. La composición de la reivindicación 1, en la que dichas moléculas de ácido nucleico son plásmidos y cada una de dichas minicélulas contiene entre 11 y 60 copias de dicho plásmido.

38. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho receptor de superficie de célula de mamífero está expresado de manera elevada en la superficie de dichas células de mamífero no fagocíticas.