Uso de trehalasa para obtener resistencia a la sequía en plantas.

El uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante para obtener tolerancia a la sequía y/o a la sal en plantas.

Uso de trehalasa para obtener resistencia a la sequía en plantas La presente invención se refiere al uso de trehalasa para obtener resistencia a la sequía y/o sal en plantas. Más específicamente, se refiere a constructos modificados genéticamente, transformados en plantas y que tienen como consecuencia la sobreexpresión de trehalasa, con lo que las plantas transformadas muestran una resistencia a la sequía significativamente mejor durante periodos de sequía, y una mejor recuperación cuando se suministra agua después del periodo de sequía.

El disacárido trehalosa (α-D-glucopiranosil-1, 1-α-D-glucopiranósido) es un azúcar no reductor que se encuentra en una diversidad de organismos, incluidas plantas. El papel de la trehalosa se ha asociado a menudo con resistencia al estrés, particularmente resistencia a la desecación. Jang y col. (2003) describen la construcción de plantas de arroz transgénicas con tolerancia al estrés abiótico aumentada, mediante la expresión de una fusión de los genes de Escherichia coli por la trehalosa-6-fosfato sintasa y la trehalosa-6-fosfato fosfatasa. Suarez y col. (2008) obtuvieron una mejora de la tolerancia a la sequía en alubias comunes mediante la sobreexpresión de trehalosa-6-fosfato sintasa. En esos estudios, la acumulación de trehalosa se promueve aumentando la biosíntesis.

No obstante, además de por la ruta biosintética, el nivel de trehalosa puede estar influenciado por la degradación de trehalosa. La trehalasa es la única enzima conocida en Arabidopsis capaz de degradar la trehalosa en dos unidades de glucosa. La expresión de su gen, AtTRE1, está significativamente regulada al alza durante etapas de desarrollo de la planta específicas tales como floración y senescencia y durante condiciones de estrés. Debido a la conexión estrecha entre el metabolismo de la trehalosa y procesos vitales de la planta, el control de nivel restrictivo de trehalosa, o indirectamente de T6P, mediante la actividad de trehalosa puede ser crucial en la regulación fina de estos metabolitos/estas señales y, subsiguientemente, en el control del crecimiento y el desarrollo de la planta. La trehalasa también puede movilizar niveles de trehalosa inducidos por estrés para permitir la reparación celular subsiguiente, como en el caso de organismos inferiores. Además, una actividad de trehalasa alta también puede evitar perturbaciones del metabolismo del carbono mediante trehalosa externa, liberada por microbios patógenos o simbióticos. No obstante, a pesar de su implicación en múltiples procesos, se sabe poco sobre el papel exacto de la trehalasa en plantas superiores.

El documento EP 0784095 divulga la acumulación de trehalosa en patata después de la inhibición de trehalasa, bien por adición del inhibidor de trehalasa validamicina A o bien mediante la expresión de ARN antisentido de trehalasa. No obstante, estos experimentos de inhibición se llevaron a cabo en plantas que sobreexpresan trehalosa-6-fosfato sintasa, dificultando hacer una distinción entre el efecto de la sobreexpresión de la sintasa y el de la inhibición de la trehalasa. El documento WO 2008095919 divulga el uso de la sobreexpresión de un gen de trehalasa para conferir resistencia a nematodos a plantas. No obstante, no se hacía referencia a tolerancia a la sequía o a la sal. Por el contrario, se indicaba que concentraciones de trehalosa superiores tienen como consecuencia una tolerancia aumentada a la sequía y al estrés.

Sorprendentemente, encontramos que la sobreexpresión de trehalasa tiene como consecuencia una mejor tolerancia a la sequía y un mejor crecimiento después de volver a regar después de un periodo de sequía. La inactivación del gen de trehalasa provoca una disminución de la tolerancia a la sequía.

Un primer aspecto de la invención es el uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante para obtener tolerancia a la sequía y/o sal en plantas.

La trehalasa, tal como se usa en la presente memoria, significa una glicósido hidrolasa que convierte trehalosa en glucosa. Las trehalasas son conocidas por el experto en la técnica e incluyen, pero sin limitación, trehalasas bacterianas, fúngicas y vegetales. Preferentemente, dicha trehalasa es una Arabidopsis trehalasa, incluso más preferente es la Arbidopsis trehalasa TRE1 (número de acceso de Genbank NM_118536) . Una trehalasa recombinante, tal como se usa en la presente memoria, significa que el ácido nucleico que codifica la trehalasa se ha aislado, ha sido opcionalmente modificado y se ha introducido en una planta, dando como resultado una tolerancia a la sequía y/o al estrés modificada. Dicho ácido nucleico puede tener una secuencia codificante 55 optimizada. Secuencias codificantes optimizadas, tal como se usa en la presente memoria, incluye, como ejemplo no limitante, optimación de codón para una mejor traducción, así como mutaciones que pueden aumentar la actividad específica de la proteína. No obstante, la modificación del ácido nucleico es opcional. Como ejemplo no limitante del uso de una trehalasa sin modificación, puede introducirse en la planta el gen de una especie, incluso una especie que no sea vegetal. Dicha introducción puede ser una única copia o pueden introducirse varias copies. Como alternativa, la planta puede transformarse con el gen endógeno para obtener un número de copias superior del gel y, de este modo, una expresión superior de la proteína trehalasa. Tolerancia a la sequía, tal como se usa en la presente memoria, comprende tolerancia a la sequía durante el cultivo, así como tolerancia a la sequía después de la cosecha, dando como resultado una mayor duración en almacenamiento de la planta cosechada. Como ejemplo no limitante, la tolerancia a la sequía después de la cosecha puede tener como consecuencia una duración en 65 almacenamiento superior de flores ornamentales, o una duración en almacenamiento superior de hortalizas, preferentemente hortalizas tales como, pero sin limitación, lechuga o espinaca.

Preferentemente, dicha sobreexpresión de dicha trehalasa se encuentra específicamente en las células de guarda del estoma. Expresión específica en las células de guarda del estoma, tal como se usa en la presente memoria, significa que la expresión está principalmente influenciada por las células de guarda del estoma, preferentemente existe expresión en las células de guarda del estoma y no hay expresión en las células mesófilas o epidérmicas de las hojas de la planta o del tallo de la planta, pero puede existir expresión en partes de la raíz o de las flores. Dicha sobreexpresión específica puede realizarse mediante el promotor endógeno de Arabidopsis thaliana TRE1.

Los métodos para obtener la sobreexpresión de trehalasa recombinante son conocidos por el experto en la técnica, e incluyen, pero sin limitación, aumentar del número de copias de genes de trehalasa, disponer la secuencia codificante de trehalasa bajo el control de un promotor fuerte o eliminar elementos represores del promotor. Preferentemente, la sobreexpresión de trehalasa se obtiene mediante el aislamiento de un gen de trehalasa, adaptándolo para la sobreexpresión y transformándolo en el interior de una planta. Preferentemente, dicha sobreexpresión tiene como consecuencia una tolerancia aumentada a la sequía. Preferentemente, dicha trehalasa se dispone después de un promotor específico de los estomas y dicha sobreexpresión se produce específicamente en las células de guarda del estoma. Otro aspecto más de la invención es el uso de la sobreexpresión de trehalasa para obtener un crecimiento mejorado después de volver a regar después de un periodo de sequía. Volver a regar, tal como se usa en la presente memoria, significa que después de un periodo de sequía, la planta se expone de nuevo al agua. Crecimiento mejorado, tal como se usa en la presente memoria, incluye, entre otras cosas, un periodo de adaptación más reducido después de empezar a volver a regar y un mejor crecimiento después de la adaptación.

Otro aspecto de la invención es el uso de una sobreexpresión de trehalasa recombinante según al invención para limitar la apertura de células del estoma y/o el número de células del estoma por unidad de superficie foliar y/o el

índice estomático. Preferentemente, la modulación de la función estomática se realiza mediante la modulación de la apertura del estoma. Preferentemente, dicho uso de trehalasa es la sobreexpresión y dicha modulación de la función estomática es una limitación de la apertura del estoma. Es evidente para el experto en la técnica que una limitación de la apertura del estoma o y/o una disminución del número de células de guarda del estoma por superficie foliar o y/o una disminución del índice estomático puede limitar... [Seguir leyendo]

1. El uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante para obtener tolerancia a la sequía y/o a la sal en plantas.

2. El uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante según la reivindicación 1 para obtener un crecimiento mejorado tras volver a regar después de un periodo de sequía.

3. El uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha sobreexpresión es específica para las células de guarda de los estomas. 10

4. El uso de las sobreexpresión de trehalasa recombinante para modular la función de las células de guarda de los estomas.

5. El uso de la sobreexpresión de trehalasa recombinante según la reivindicación 4, con lo que dicha modulación de 15 la función de los estomas es una limitación de la apertura de los estomas.